Untersuchungen zum Transport von Organellen in Neurospora crassa: molekulare Charakterisierung eines Mechanoenzyms der Kinesin-Superfamilie
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I
NHALTSVERZEICHNIS
A
BKUERZUNGEN
.
IV
1.
E
INLHTUNG
.
1
2.
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
7
2.1
REAGENZIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
7
2.2
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
7
2.2.1
ANZUCHT
VON
NEUROSPORA
CRASSA
.
7
2.2.2
ANZUCHT
VON
SYNCEPHALASTRUMRACEMOSUMMDDICTYOSTELIUMDISCOIDEUM.
.
8
2.2.3
ANZUCHT
VON
ASPERGILLUS
NIDULANS
.
8
2.2.4
ANZUCHT
VON
CHLAMYDOMONAS
REINHARDII
.
8
2.2.5
BAKTERIENSTAEMME,
NAEHRMEDIEN,
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
.
9
2.3
LICHTMIKROSKOPIE
.
9
2.3.1
FLUORESZENZFAERBUNG
VON
ORGANELLEN,
ZYTOSKELETTELEMENTEN
UND
NKIN.
.
10
2.3.1.1
IMMUNOFLUORESZENZ
VON
MIKROTUBULI
UND
AKTINFILAMENTEN
.
10
2.3.1.2
FAERBUNG
VON
KERNEN
UND
MITOCHONDRIEN
.
10
2.3.1.3
IMMUNOFLUORESZENZ
VON
NKIN
.
11
2.3.2
UNTERSUCHUNG
DES
ORGANELLENTRANSPORTS
IN
VIVO
.
11
2.3.2.1
PRAEPARATION
VON
N.
CRASSA-PROTOPLASTEN
.
11
2.3.2.2
PRAEPARATION
VON
N.
CRASSA-ZELLFRAGMENTEN
.
12
2.3.2.3
QUANTITATIVE
ANALYSE
VON
ORGANELLENBEWEGUNG
IN
VIVO
.
12
2.3.2.4
MANIPULATION
VON
ORGANELLENBEWEGUNG
IN
EINER
FLIESSKAMMER
.
13
2.3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
MOTORAKTIVITAET
.
13
2.3.3.1
IN
WIRO-ANSATZ
ZUR
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
("GLIDING
ASSAY")
.
13
2.3.3.2
BESTIMMUNG
DER
NUKLEOTIDSPEZIFITAET
VON
NKIN
UND
ABSCHAETZUNG
DER
MINIMALKONZENTRATION
FUER
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
.
14
2.3.3.3
BESTIMMUNG
DER
BEWEGUNGSRICHTUNG
VON
ISOLIERTEN
MOTOREN
.
14
2.3.3.4
EINFLUSS
VON
PH-VARIATION
UND
HEMMSTOFFEN
AUF
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
.
.
.
14
2.3.3.5
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTEFUER
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
.
.
15
2.3.3.6
MOTILITAETSANSATZ
MIT
LATEXKUGELN
.
15
2.3.3.7
MOTILITAETSANSATZ
MIT
ORGANELLEN
.
15
2.4
BIOCHEMIE
.
16
2.4.1
ALLGEMEINE
METHODEN
.
16
2.4.1.1
SDS-PAGE
.
16
2.4.1.2
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
PAA-GELEN
.
17
2.4.1.3
KONZENTRATIONS-,
MOLEKULARGEWICHTS
UND
MENGENABSCHAETZUNG
VON
PROTEINEN
17
2.4.2
ISOLATION
VON
PROTEINEN
.
18
2.4.2.1
ISOLATION
VON
TUBULIN
AUS
SCHWEINEGEHIRNEN
.
18
2.4.2.2
ISOLATION
VON
KINESIN
AUS
PILZEN
UND
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
.
19
2.4.2.3
ISOLATION
VON
KINESIN
AUS
RINDERGEHIRNEN
.
22
2.4.3
SPEZIELLE
METHODEN
.
23
2.4.3.1
ABSCHAETZUNGDESSEDIMENTATIONSKOEFFIZIENTEN
.
23
2.4.3.2
BESTIMMUNG
DES
STOKES-RADIUS
UND
DER
DIFFUSIONSKONSTANTEN
.
24
2.4.3.3
KALKULATION
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTS
.
25
II
2.4.3.4
ABSCHAETZUNG
DER
ACHSENVERHAELTNISSE
.
25
2.4.3.5
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
ATPASE-AKTIVITAET
.
26
2.4.3.6
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
DER
ATPASE
.
27
2.4.3.7
POLYMERISATION
VON
TUBULIN
IN
VITRO
.
27
2.4.4
ANTIKOERPER
.
27
2.4.4.1
HERSTELLUNG
DES
ANTISERUMS
GEGEN
MOTORMOLEKUELE
AUS
N.
CRASSA
.
27
2.4.4.2
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
28
2.4.4.3
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
MITTELS
IMMUNOBLOT
(WESTERN
BLOT)
.
28
2.4.4.4
BESTIMMUNG
DES
PROZENTUALEN
ANTEILS
VON
NKIN
AM
LOESLICHEN
PROTEIN
.
29
2.5.
ARBEITEN
MIT
ORGANELLEN
.
30
2.5.1
ISOLATION
VON
ORGANELLEN
.
30
2.5.1.1
MITOCHONDRIEN
AUS
N.
CRASSA
.
30
2.5.1.2
MIKROSOMALE
FRAKTION
AUS
N.
CRASSA
.
30
2.5.1.3
MEMBRANOESE
ORGANELLEN
AUS
N.
CRASSA,
S.RACEMOSUMMOEA.NIDULANS
.
.
30
2.5.1.4
MEMBRANOESE
ORGANELLEN
AUS
SCHWEINEGEHIRNEN
.
31
2.5.1.5
MITOCHONDRIEN
AUS
RATTENLEBER
.
31
2.5.1.6
AXONEME
AUS
C.
RE/N/IARCFFI-FLAGELLEN
.
31
2.5.2
KOISOLATION
VON
MOTORMOLEKUELEN
MIT
ORGANELLEN
.
32
2.5.3
//?
V/FRO-ANHEFTUNG
VON
MOTORMOLEKUELEN
AN
ORGANELLEN
.
32
2.6
MOLEKULARBIOLOGIE
.
33
2.6.1
ALLGEMEINE
METHODEN
.
33
2.6.1.1
MIKROSEQUENZIERUNG
.
33
2.6.1.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
33
2.6.1.3
ISOLATION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
UND
PRAEZIPITATION
DER
DNA
.
33
2.6.1.4
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
.
34
2.6.1.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
34
2.6.1.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
34
2.6.1.7
NACHWEIS
VON
DNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
(SOUTHERN
BLOT)
.
35
2.6.1.8
NACHWEIS
VON
RNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
(NORTHERN
BLOT)
36
2.6.1.9
"IMMUNOSCREENING"
EINER
CDNA-BANK
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
MOTORENZYM
36
2.6.1.10
"SCREENING
"
VON
DNA-BANKEN
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTER
DNA
.
37
2.6.1.11
AMPLIFIKATION
VON
X-PHAGEN
UND
ISOLATION
IHRER
DNA
.
38
2.6.1.12
LIGIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
VEKTOREN
.
38
2.6.1.13
HERSTELLUNGTRANSFORMATIONSKOMPETENTERZELLEN
.
38
2.6.1.14
TRANSFORMATION
VON
VEKTOREN
IN
ESCHERICHA
COLI
.
39
2.6.1.15
IDENTIFIKATION
VON
TRANSFORMIERTEN
KLONEN
MITTELS
RADIOAKTIVEM
"SCREENING
"
.
.
39
2.6.1.16
ISOLATION
VON
PLASMIDEN
AUS
ESCHERICHA
COLI
.
40
2.6.1.17
SEQUENZIERUNG
DER
DNA
.
40
2.6.1.18
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
41
2.6.1.19
COMPUTERANALYSE
DER
NUKLEOTID-UND
AMINOSAEURESEQUENZ
.
42
2.6.2
METHODEN
ZUR
VERVOLLSTAENDIGUNG
DES
5'-ENDES
DER
SEQUENZ
.
43
2.6.2.1
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
N.
CRASSA
.
43
2.6.2.2
VERLAENGERUNG
DER
CDNA
DURCH
5
'-RACE
.
43
2.6.3
ISOLATION
UND
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
GENOMISCHEN
DNA
AUS
N.
CRASSA
.
45
2.6.4
LAGE
UND
SEQUENZ
DER
VERWENDETEN
SEQUENZIER
UND
PCR-OLIGONUKLEOTIDE
.
46
III
3,
E
RGEBNISSE
.
48
3.1
DIE
ZELLEN
.
47
3.2
BEWEGUNG
DER
ORGANELLEN
IN
VIVO
.
47
3.2.1
PARTIKEL
.
48
3.2.2
MITOCHONDRIEN
.
48
3.2.3
KERNE
UND
VAKUOLEN
.
48
3.3
ANDERE
BEWEGUNGSPHAENOMENE
.
49
3.4
INTRAZELLULAERE
BEWEGUNG
UND
DAS
ZYTOSKELETT
.
49
3.5
ISOLATION
EINES
ZYTOLASMATISCHEN
MOTORENZYMS
AUS
N.
CRASSA
.
58
3.5.1
DAS
ISOLATIONSPROTOKOLL
.
58
3.5.2
ANDERE
PROTEINE
IM
S5
.
59
3.5.3
STABILITAET
DES
AFEUROSPORA-MOTORS
.
60
3.6.
MOTILITAETSEIGENSCHAFTEN
VON
NKIN
.
66
3.6.1
NUKLEOTIDSPEZIFITAET,
MINIMALMENGE
FUER
DIE
BEWEGUNG,
EINFLUSS
VON
AMP-PNP,
NEM,
VANADAT
UND
PH
VARIATION
AUF
DIE
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
.
66
3.6.2
BEWEGUNGSRICHTUNG
.
67
3.6.3
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
DER
MIKROTUBULI-BEWEGUNG
.
68
3.7
BIOCHEMISCH-BIOPHYSIKALISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
NKIN
.
68
3.7.1
SPEZIFISCHE
ATPASE-AKTIVITAET
UND
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
DER
ATPASE
.
68
3.7.2
SEDIMENTATIONS
UND
DIFFUSIONSKOEFFIZIENT,
STOKES-RADIUS
UND
ACHSENVERHAELTNIS
70
3.7.3
NATIVES
MOLEKULARGEWICHT
UND
ZUSAMMENSETZUNG
VON
NKIN
.
70
3.7.4
ANTEIL
VON
NKIN
AM
ZYTOPLASMATISCHEN
PROTEIN
.
71
3.8
IMMUNOLOGISCHE
AEHNLICHKEITEN
VON
NKIN
ZU
ECHTEN
KINESINEN
.
78
3.9
FUNKTIONSANALYSE
VON
NKIN
.
78
3.9.1
LOKALISATION
DES
MOTORS
MITTELS
IMMUNOFLUORESZENZ
.
78
3.9.2
BINDUNG
VON
NKIN
AN
ISOLIERTE
ORGANELLEN
.
79
3.9.3
BEWEGUNG
VON
ORGANELLEN
IN
VITRO
.
79
3.10
NUKLEOTID-UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NKIN
.
84
3.10.1
DIE
KLONIERUNGSSTRATEGIE
.
84
3.11
NACHWEIS
DES
NKIN-GENS
IN
DER
GENOMISCHEN
DNA
VON
N.
CRASSA
.
86
3.12
ANALYSE
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NKIN
.
94
3.12.1
MOLEKULARGEWICHT,
ISOELEKTRISCHER
PUNKT,
MOTIVE
UND
DOMAENENSTRUKTUR
.
94
3.12.2
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NKIN
MIT
SEQUENZEN
ANDERER
PROTEINE
.
94
3.12.2.1
DIE
MOTORDOMAENE
.
95
3.12.2.2
DER
SCHWANZDOMAENE
.
96
3.13
ZYTOPLASMATISCHE
MOTOREN
AUS
ANDEREN
NIEDEREN
ORGASNISMEN
.
104
4.
D
ISKUSSION
.
109
5.
Z
USAMMENFASSUNG
.
127
6.
L
ITERATUR
.
129
D
ANKSAGUNGEN
.
143
L
EBENSLAUF
.
145 |
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| spelling | Steinberg, Gero Verfasser aut Untersuchungen zum Transport von Organellen in Neurospora crassa molekulare Charakterisierung eines Mechanoenzyms der Kinesin-Superfamilie von Gero Steinberg 1995 V, 145 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 1995 Neurospora crassa (DE-588)4171597-4 gnd rswk-swf Kinesin (DE-588)4236029-8 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Neurospora crassa (DE-588)4171597-4 s Kinesin (DE-588)4236029-8 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006948814&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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