Funktionsanalyse der humanen U5 snRNA:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
_
5
1.1
ENTDECKUNG
DES
RNA-SPLICINGS
5
1.2
BEDEUTUNG
DER
INTRON-EXON
STRUKTUR
EUKARYOTISCHER
GENE
6
1.3
EVOLUTION
DES
RNA-SPLICING
7
1.4
REIFUNG
VON
PRAE-MRNAS
IN
EUKARYONTEN
8
1.4.1
E/S-SPLICING
8
1.4.2
RRANS-SPLICING
9
1.4.3
SELF-SPLICING
10
1.4.4
WEITERE
FORMEN
DER
PRAE-MRNA
PROZESSIERUNG
13
L.S
SPLICINGFAKTOREN
UND
IHRE
FUNKTION
13
1.5.1
ALLGEMEINE
MERKMALE
SPLICEOSOMALER
SNRNPS
13
1.5.2
REIFUNG
DER
SPLICEOSOMALEN
SNRNPS
15
1.5.3
STRUKTUR
UND
FUNKTION
EINZELNER
SNRNPS
17
1.5.4
NON-SNRNP
SPLICINGFAKTOREN
22
1.6
ASSEMBLIERUNG
DES
SPLICEOSOMS
24
1.7
SPLICINGKATALYSE
26
1.8
KERNLOKALISATION
DES
RNA-SPLICING
27
1.9
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
HUMANEN
U5
SNRNPS
-
FRAGESTELLUNG
UND
KONZEPTION
28
2.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
_
30
2.1
VERSUCH
DER
ENTWICKLUNG
EINES
IN
VITRO
REKONSTITUTIONSSYSTEMS
FUER
DEN
HUMANEN
U5
SNRNP
30
2.1.1
EINLEITUNG
30
2.1.2
KOMPONENTEN
UND
REAKTIONSPARAMETER
DER
IN
VITRO
REKONSTITUTION
31
2.1.3
OPTIMIERUNG
DES
IN
VITRO
REKONSTITUTIONSSYSTEMS
FUER
DEN
U5
SNRNP
33
2.1.4
RNA-PROTEIN
INTERAKTION
AN
DER
SM-BINDUNGSSTELLE
DES
U4
UND
DES
U5
SNRNPS
37
2.1.5
DISKUSSION
38
2.2
ETABLIERUNG
VON
IN
VIVO
EXPRESSIONSSYSTEMEN
ZUR
FUNKTIONELLEN
ANALYSE
DES
HUMANEN
U5
SNRNPS
41
2.2.1
EINLEITUNG
41
2.2.2
DAS
EXPRESSIONSKONSTRUKT
PGEM4
U2/U5
41
2.2.3
DAS
EXPRESSIONSKONSTRUKT
PGEM4
U1/U5
43
2.2.4
IN
VIVO
EXPRESSION
HUMANER
U5
SNRNA
44
2.2.5
DISKUSSION
47
2.3
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
U4/U5/UE6
TRIPLE-SNRNPS
UND
SPLICINGKOMPLEXEN
48
2.3.1
EINLEITUNG
48
2.3.2
NACHWEIS
DER
U5
SNRNA
M
AFFINITAETSGEREINIGTEN
U4/U5/U6
TRIPLE-SNRNPS
48
2.3.3
NACHWEIS
VON
U5
SNRNA
IN
AFFINITAETSGEREINIGTEN
SPLICINGKOMPLEXEN
51
2.3.4
DISKUSSION
54
2.4
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
HUMANEN
U5
SNRNA
IN
VIVO
56
2.4.1
EINLEITUNG
56
2.4.2
EXPRESSION
DER
U5
SNRNA
DERIVATE
IN
293
ZELLEN
59
2.4.3
DIE
3
'
-DOMAENE
DER
U5
SNRNA
IST
FUER
DIE
BILDUNG
DER
TMG-CAP-STRUKTUR
ERFORDERLICH
61
2.4.4
DER
3
'
-STEM/LOOP
IST
EINE
DETERMINANTE
FUER
DIE
BINDUNG
DER
SM-PROTEINE
63
2.4.5
DAS
U5
SNRNP
SPEZIFISCHE
PROTEIN
P220
INTERAGIERT
MIT
ELEMENTEN
DER
5
'
-DOMAENE
66
2.4.6
ELEMENTE
DER
5
'
-DOMAENE
BEEINFLUSSEN
DIE
ASSEMBLIERUNG
DES
U4/U5/U6
TRIPLE-SNRNPS
UND
DIE
BILDUNG
VON
SPLICINGKOMPLEXEN
68
2.4.7
DISKUSSION
74
3.
ZUSAMMENFASSUNG
UND
PERSPEKTIVEN
81
4.
MATERIAL
UND
METHODEN
85
4.1
MATERIAL
85
4.1.1
GERAETE
85
4.1.2
CHEMIKALIEN
UND
MATERIAL
86
4.1.3
ENZYME
87
4.1.4
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
88
4.1.5
PUFFERLOESUNGEN
88
4.1.6
SEREN
90
4.1.7
PLASMIDE
91
4.2
ZELLKULTUR,
TRANSFEKTIONSMETHODEN
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
91
4.2.1
KULTIVIERUNG
VON
HELA-ZELLEN
91
4.2.2
KULTIVIERUNG
VON
293
ZELLEN
91
4.2.3
ANLEGEN
VON
STOCKS
91
4.2.4
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
DER
KALZIUMPHOSPHAT-KOPRAEZIPITATIONSMETHODE
(GRAHAM
UND
VAN
DER
EB,
1973)
91
4.2.5
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
TRANSFECTAM
92
4.2.6
KEMEXTRAKTE
AUS
HELA-ZELLEN
92
4.2.7
PRAEPARATION
VON
MINIEXTRAKTEN
AUS
293
STELLEN
(LEE
ET
AL.,
1988)
92
4.2.8
PRAEPARATION
VON
ZELLEXTRAKTEN
93
4.2.9
PRAEPARATION
VON
SNRNP-REKONSTITUTIONSEXTRAKTEN
93
4.2.10
U5
SNRNP
DEPLETIERUNG
VON
KEMEXTRAKTEN
94
4.2.11
HERSTELLUNG
VON
U5
SNRNP-PROTEINEXTRAKTEN
94
4.2
12
RNA-PRAEPARATION
AUS
ZELLEXTRAKTEN
94
4.3
PLASMIDE,
OLIGONUKLEOTIDE
UND
SYNTHETISCHE
RNAS
94
4.3.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION,
PCR)
94
4.3.2
DNA
UND
2
'
-OME
RNA-OLIGONUKLEOTIDE
95
4.3.3
ELUTION
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
96
4.3.4
HERSTELLUNG
VON
PLASMIDKONSTRUKTEN
96
4.3
.5
SYNTHESE
VON
RNA
DURCH
IN
VI/RO-TRANSKRIPTION
MIT
RNA
POLYMERASEN
DER
PHAGEN
T7
UND
SP6
(MELTON
ET
AL.,
1984;
MILLIGAN
ET
AL.,
1987)
97
4.3.6
5
'
-ENDMARKIERUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
DURCH
[Y
32
P]ATP
UND
POLYNUKLEOTID
KINASE
(PNK)
(CHACONAS
&
VAN
DE
SANDE,
1980)
98
4.3.7
3
'
-ENDMARKIERUNG
VON
RNA
DURCH
[5'
32
P]PCP
UND
T4-RNA-LIGASE
(ENGLAND
ET
AL.,
1980)98
4.3
8
GELREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
RNAS
98
4.3.9
RESTRIKTIONSSPALTUNG
UND
KLONIERUNG
98
4.3.10
RNA-RENATURIERUNG
99
4.4
DETEKTIONSMETHODEN
99
4.4.1
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
99
4.4.2
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
(KONARSKA
&
SHARP,
1986;
NELSON
&
GREEN,
1988)
99
4.4.3
AUTORADIOGRAPHIE
99
4.4.4
PRIMER
EXTENSION
ANALYSE
100
4.4.5
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
100
4.4.6
SILBERFARBUNG
100
4.4.7
PHOSPHOR-IMAGER-ANALYSE
101
4.S
SEDIMENTATIONSANALYSE
VON
SNRNPS
IN
GLYCEROLGRADIENTEN
101
4.6
ANALYSE
VON
SNRNPS
DURCH
CSCL-DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
(PIKIELNY
ET
AL.,
1989)
101
4.7
CHEMISCHE
MODIFIKATIONS/INTERFERENZ-ANALYSE
(PEATTIE,
1979;
CONWAY
&
WICKENS,
1987)
102
4.8
IN
VITRO
SPIICING
VON
PRAE-MRNAS:
ANALYSE
VON
SPLICINGPRODUKTEN
UND
SPLICINGKOMPLEXEN
103
4.9
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
US
SNRNAS
MIT
ANTI-TMG-ANTIKOERPERN
BZW.
SERUM
103
4.10
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
U5
SNRNPS
MIT
ANTI-SM-SERUM
104
4.11
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
U5
SNRNPS
MIT
ANTI-P220-SERUM
104
4.12
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
U4/UE5/UE6
TRIPLE-SNRNPS
105
4.13
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
SPLICINGKOMPLEXEN
105
5.
LISTE
DER
ABKUERZUNGEN
107
6.
LITERATURVERZEICHNIS
109 |
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