Entwicklung eines Testsystems zur Überwachung und Risikoabschätzung von gentechnisch veränderten Mikroorganismen bei der Einleitung ins Abwasser:
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1995
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INHALT
DANKSAGUNG 7
LEBENSLAUF 10
1 EINFUEHRUNG 11
1.1 DAS OEKOSYSTEM: BELEBTSCHLAMM 13
1.2 BAKTERIELLE PLASMIDE ^ 14
1.3 KONJUGATION 15
2 DIE LABOR-KLAERANLAGEN 18
2.1 AUFBAU, FUNKTION UND STEUERUNG DER MODELL-KLAERANLAGEN 18
2.2 DAS KUENSTLICHE ABWASSER 22
2.3 BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN PARAMETER 23
2.4 BESTIMMUNG DER CHEMISCHEN PARAMETER 26
3 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE 30
3.1 AUSWAHL DER BAKTERIENSTAEMME 30
3.2 AUSWAHL UND KONSTRUKTION DER PLASMIDE 33
3.3 KONSTRUKTION DER DONORSTAEMME DURCH TRANSFORMATION 45
3.4 UEBERBLICK UEBER DIE IN DEN MODELL-KLAERANLAGEN EINGESETZTEN
DONORSTAEMME 48
3
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4 ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG VON PLASMID- UND FRAGMENT
DNA SOWIE KLONIERUNG VON FRAGMENT-DNA IN PLASMIDE 51
4.1 ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS REINKULTUREN 51
4.2 AUFTRENNUNG VON PLASMIDEN IN EINZELNE DNA-FRAGMENTE 55
4.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 57
4.4 SUBKLONIEREN VON DNA-FRAGMENTEN IN PLASMIDE 58
4.5 ENTWICKLUNG VON GENSONDEN 61
4.6 SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG
63
4.7 KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
64
4.8 IMMUNO-NACHWEIS GELABELTER NUKLEINSAEUREN 66
4.9 CHEMILUMINESZENZ-DETEKTION GELABELTER NUKLEINSAEUREN 67
4.10 KONSTRUKTION UND UEBERPRUEFUNG DER
LUXAB- UND DER DHFR-GENSONDE 68
5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
74
5.1 UEBERPRUEFUNG DES ZUXAB-FRAGMENTS DURCH DNA-SEQUENZIERUNG NACH SAENGER
75
5.2 ERGEBNISSE DER SEQUENTREAKTION
78
5.3 ERARBEITUNG DES PCR-PROTOKOLLS
81
5.4 QUALITATIVER NACHWEIS DES
LUXAB-GENS AUS KLAERSCHLAMM MIT HILFE DER PCR 86
5.5 VERSUCHE ZUM QUANTITATIVEN NACHWEIS VON
LUXAB-DNA AUS
BELEBTSCHLAMMPROBEN MIT HILFE DER PCR 87
6 VORUNTERSUCHUNGEN ZUM PLASMIDTRANSFER VON GENTECHNISCH
VERAENDERTEN MIKROORGANISMEN IM BELEBTSCHLAMM 100
6.1 KONJUGATIONSEXPERIMENTE VON GRAM-NEGATIVEN GENTECHNISCH VERAENDERTEN
BAKTERIEN AUF DAS BELEBTSCHLAMM-ISOLAT PSEUDOMONAS PUTIDA AZ10 100
6.2 MOBILISIERUNG VON NICHT-KONJUGATIVEN PLASMIDEN AUS GENTECHNISCH
VERAENDER
TEN MIKROORGANISMEN DURCH BAKTERIEN-WILDSTAEMME AUS DEM BELEBTSCHLAMM 104
4
6.3 PLASMIDTRANSFER VON GENTECHNISCH VERAENDERTEN GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
MIT DEM SHUTTLE-VEKTOR PKM4 113
6.4 ERSTE PERSISTENZUNTERSUCHUNGEN IM BELEBTSCHLAMM 116
6.5 ERSTE NACHWEISE VON PLASMIDEN AUS BELEBTSCHLAMMPROBEN 118
7 METHODEN ZUM NACHWEIS DER UEBERLEBENSRATEN UND DES
PLASMIDTRANSFERS VON GENTECHNISCH VERAENDERTEN MIKRO
ORGANISMEN IN DEN MODELL-KLAERANLAGEN 119
7.1 SCHEMA DER PROBENAUFARBEITUNG AUS DEN MODELL-KLAERANLAGEN 120
7.2 PROBENAHME AUS DEN MODELL-KLAERANLAGEN 121
7.3 ISOLIERUNG UND NACHWEIS VON PLASMID-DNA AUS KLAERSCHLAMM 121
7.4 ISOLIERUNG VON BAKTERIEN AUS DEM KLAERSCHLAMM 123
8 ERGEBNISSE: EINSATZ VON GENTECHNISCH VERAENDERTEN MIKRO
ORGANISMEN IN DEN MODELL-KLAERANLAGEN - UEBERLEBENSRATEN
UND PLASMIDTRANSFER 124
8.1 EINSATZ VON
ESCHERICHIA COLI S17-1 (PHM25) 128
8.2
F.INSATR VON ESCHERICHIA COLI W3110 KL2 (PHM25) 152
8.3 EINSATZ VON
ESCHERICHIA COLI W3110 K12 (PAZ2) 158
8.4 EINSATZ VON
ESCHERICHIA COLI W3110 K12 (PAZL) 161
8.5 EINSATZ VON
PSEUDOMONAS PUTIDA 549 (PHM25) 162
8.5 EINSATZ VON
BACILLUS SUBTILIS 168 (PKM4) 176
9 AUSWERTUNG UND DISKUSSION 179
9.1 DIE LABOR-KLAERANLAGEN 179
9.2 DIE NACHWEISMETHODEN FUER DIE UEBERLEBENSRATEN UND DEN PLASMIDTRANSFER
VON GENTECHNISCH VERAENDERTEN BAKTERIEN IN DEN MODELL-KLAERANLAGEN 180
5
9.3
DIE UEBERLEBENSRATEN DER EINGESETZTEN GENTECHNISCH VERAENDERTEN
MIKROORGANISMEN IN DEN MODELL-KLAERANLAGEN - EIN VERGLEICH 183
9.4 RISIKOABSCHAETZUNG BEI DER EINLEITUNG GENTECHNISCH VERAENDERTER
MIKROORGANISMEN INS BERLINER ABWASSER - HORIZONTALER GENTRANSFER 185
10 ZUSAMMENFASSUNG 191
11 ANHANG 195
11.1 LITERATURVERZEICHNIS 195
11.2 UEBERSICHT: ABBILDUNGEN 202
11.3 UEBERSICHT: TABELLEN 207
11.4 UEBERSICHT: ABKUERZUNGEN 209
11.5 BEISPIELE FUER DIE KOLONIE-HYBRIDISIERUNG VON LUX-POSITIVEN
BAKTERIEN
AUS DER MODELL-KLAERANLAGE 211
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