Proteinanalytische Charakterisierung pathogenesespezifischer Vorgänge im Wurzelgewebe von Arabidopsis thaliana nach Infektion mit dem Rübenzystennematoden Heterodera schachtii Schmidt:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
4
MATERIALVERZEICHNIS
7
1
EINLEITUNG
13
2
ARBEITSGEBIET
15
2.1
DER
NEMATODE
-
HETERODERA
SCHACHTII
SCHMIDT
15
2.2
DIE
PFLANZE
-
ARABIDOPSIS
THALIANA
15
2.3
DAS
NAEHRZELLENSYSTEM
-
SYNCYTIUM
16
2.4
DIE
NAEHRZELLENBILDUNG
-
PHYSIOLOGISCHE
UND
18
MOLEKULARE
HINTERGRUENDE
2.4.1
UNTERSUCHUNGENDESPROTEINSTATUS
'18
2.4.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSEN
21
2.4.3
PROMOTOR-STUDIEN
23
3
MATERIAL
UND
METHODEN
25
3.1
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
UND-SELEKTION
25
3.1.1
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
25
3.1.2
HYBRIDOMSELEKTION
25
3.1.3
LOESUNGEN
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
27
3.1.4
BESTIMMUNG
DER
IMMUNGLOBULMKLASSE
28
3.2
PFLANZEN
UND
NEMATODEN
29
3.2.1
KULTIVIERUNG
DER
PFLANZEN
29
3.2.2
NEMATODENANZUCHT
UND
-INOKULATION
29
3.2.3
GEWINNUNG
DES
BIOLOGISCHEN
UNTERSUCHUNGSMATERIALS
29
3.3
PROTEINPROBEN
30
3.3.1
PROTEINEXTRAKTION
30
3.3.1.1
PROTEINEXTRAKTION
FUER
ANTIKOERPER
UND
ENZYMTESTS
30
3.3.1.2
PROTEINEXTRAKTION
FUER
GELELEKTROPHORETISCHE
ANALYSEN
31
3.3.2
PROTEINQUANTIFIZIERUNG
32
3.3.2.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
ET
AL.
(1951)
32
3.3.2.2
MIKRO-BRADFORD
33
3.3.3
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTES
DER
WURZELN
33
3.4
PROTEINELEKTROPHORESE
UND
-BLOTTING
34
3.4.1
SDS-POLYACRYLAMIDELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
34
3.4.2
NICHT
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID
ELEKTROPHORESE
37
3.4.3
2D-GELELEKTROPHORESE
38
3.4.3.1
1.
DIMENSION
-
IEF
40
3.4.3.2
2.
DIMENSION
-
SDS-PAGE
42
3
4.4
FAERBUNG
DER
POLYACRYLAMIDGELE
43
3
4.4.1
COOMASSIEFAERBUNG
43
3.4.4.2
SILBERFAERBUNG
44
3.4.5
PROTEINBLOTTING
45
3
4
5.1
ELEKTROBLOTTING
ZUM
IMMUNOLOGISCHEN
ANTIGENNACHWEIS
46
3.4.5
2
ELEKTROBLOTTING
ZUR
PROTEINSEQUENZIERUNG
47
3.4
6.
FAERBUNG
VON
PROTEINBLOTS
48
3
4.6.1
GESAMTFAERBUNG
VON
WESTEM-BLOTS
48
3.4
6.2
GESAMTFAERBUNG
VON
PVDF-MEMBRANEN
48
3
4.7
RECHNERGESTUETZTE
ANALYSE
VON
ELEKTROPHORESEGELEN
49
3
4
7.1
ANALYSE
VON
GELEN
AUS
DER
SDS-PAGE
49
3
4
7.2
ANALYSE
VON
2D-GELEN
49
35
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
50
3.5.1
GLYKOPROTEINE
50
3.5
2
PROTEINSEQUENZIERUNG
53
3.6
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISVERFAHREN
57
3
6.1
WESTEM-BLOTTING
57
3
6.2
DOT-BLOT-TEST
58
3
6.3
TISSUE-PRINTING
59
3.6.4
MIKROSKOPIE
60
3.6.4.1
FIXIERUNG
UND
EINBETTUNG
60
3.6.4.2
KRYOMIKROTOMIE
61
3.6.4.3
IMMUNMARKIERUNG
UND
FAERBUNG
61
3.6
4.4
LICHT
UND
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
62
3.7
ENZYMTESTS
62
3.7.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ENZYMFUNKTION
UND
-AKTIVITAET
63
3.7.1.1
LINAMARASEAKTIVITAET
63
3.7.1.2
MYROSINASEAKTIVITAET
64
3.7.2
ENZYMREINIGUNG
65
3.7.2.1
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
66
3.8
EXPRESSIONSBANK
UND
SELEKTION
DES
CDNA-KLONES
68
3.8.1
RNA
EXTRAKTION,
CDNA-SYNTHESE
UND
KONSTRUKTION
DER
CDNA-BANK
70
3.8.2
KULTIVIERUNG
DER
COS-ZELLEN,
EXPRESSIONSKLONIERUNG
UND
IMMUNOSCREENING
70
3.9
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
71
3.9.1
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
72
3.9.2
KLONIERUNG
72
3.9.3
TRANSFORMATION
74
3.9.4
DNA-SEQUENZIERUNG
75
3.9.5
DNA
EXTRAKTION
UND
SOUTHEM-BLOT
76
3.9.6
SOUTHEM-BLOT
78
3.9.7
DATENBANKVERGLEICH
VON
CDNA-SEQUENZEN
80
4
ERGEBNISSE
81
4.1
PROTEINE
NICHT
INFIZIERTER
WURZELN
UND
NEMATODENINFIZIERTER
81
WURZELBEREICHE
4.1.1
BESTIMMUNG
DES
GESAMTPROTEINGEHALTES
81
4.1.2
2D-GELELEKTROPHORESE
82
4.2
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
86
4.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
PYK10
92
4.3.1
ELEKTROPHORESE
UND
PROTEINBLOTTING
92
4.3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEINGLYKOSILIERUNG
95
4.3.3
IMMUNOLOGISCHE
LOKALISIERUNG
97
4.3.3.1
TISSUE
PRINTING
97
4.3.3
2
IMMUNMARKIERUNG
UND
FAERBUNG
98
4.3.4
PROTEINSEQUENZIERUNG
100
4.3.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
CDNA-KLONS
101
4.3.5.1
SOUTHEM-BLOT
105
4.3.6
SEQUENZANALYSE
105
4.3.6.1
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZ
105
4.3.6
2
VERGLEICH
HOMOLOGER
PROTEINE
110
4.3.7
ENZYMFUNKTION
UND-AKTIVITAET
112
5
DISKUSSION
119
5.1
ZUR
METHODIK
119
5.1.1
DAS
UNTERSUCHTE
MODELLSYSTEM
119
5.1.2
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
UND-AUSWAHL
120
5.1.3
2D-GELELEKTROPHORESE
UND
DIE
WEITEREN
123
VERFAHRENSSCHRITTE
5.2
ZU
DEN
ERGEBNISSEN
129
5.2.1
GESAMTPROTEINGEHALT
129
5.2.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROTEINS
PYK
10
131
5.2.2.1
FUNKTION
132
5.2.2.2
LOKALISIERUNG
136
5.2.2
3
STRUKTUR
137
5.2.3
BIOLOGISCHE
EFFEKTE
DES
GLUCOSINOLAT
146
MYROSINASE
SYSTEMS
6
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
149
6.1
ZUSAMMENFASSUNG
149
6.2
SUMMARY
151
7
LITERATURVERZEICHNIS
153 |
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