NMR-Spektroskopie zur Strukturaufklärung des viralen Proteins DsbA und des Birkenpollenallergens Betv1:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALT
I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG.!
1.1.
BEDEUTUNG
DER
NMR-SPEKTROSKOPIE
FUER
DIE
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
PROTEINEN
.
1
1.2.
DNA-BINDENDE
PROTEINE
.
1
1.2.1.
DAS
DNA-BINDENDE
PROTEIN
DSBA
.
2
1.2.2.
BIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
DSBA
.
2
1.2.3.
BISHERIGE
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN
AN
DSBA
.
4
1.3.
WIRKUNGSWEISE
VON
ALLERGENEN
.
6
1.3.1.
DAS
ALLERGENE
PROTEIN
BETVL
.
7
1.3.2.
BIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
BETVL
.
9
1.4.
ZIELE
DER
ARBEIT
.
11
2.
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
NMR-SPEKTROSKOPIE.L2
2.1.
GRUNDLAGEN
DER
NMR-SPEKTROSKOPIE
.
12
2.1.1.
KERNSPINRESONANZ
.
12
2.1.2.
FT-NMR
.
14
2.1.3.
CHEMISCHE
VERSCHIEBUNG
.
16
2.1.4.
SKALARE
SPIN-SPIN-KOPPLUNG
.
16
2.1.5.
DER
KEM-OVERHAUSER-EFFEKT
.
17
2.2.
2D-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
19
2.2.1.
DAS
COSY-EXPERIMENT
.
21
2.2.2.
DAS
NOESY-EXPERIMENT
.
22
2.2.3.
DAS
TOCSY-EXPERIMENT
.
23
2.3.
3D-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
24
2.4.
ZUORDNUNG
DER
PROTONENRESONANZEN
.
26
2.4.1.
IDENTIFIZIERUNG
DER
SPINSYSTEME:
.
26
2.4.2.
SEQUENZSPEZIFISCHE
ZUORDNUNG
DER
SPINSYSTEME
.
27
2.5.
STRUKTURBESTIMMENDE
INFORMATIONEN
AUS
DEN
NMR-SPEKTREN
.
28
2.5.1.
NOE-RESONANZEN
.
28
2.5.2.
CHEMISCHE
VERSCHIEBUNG
DER
CA-PROTONEN
.
29
2.5.3.
AMIDPROTONENAUSTAUSCH
.
30
II
INHALT
2.6.
STRUKTURBERECHNUNG
.
30
2.6.1.
ALLGEMEINES
.
30
2.6.2.
"RESTRAINED
MOLECULAR
DYNAMICS"
.
31
2.6.3.
MOLEKUELDYNAMIK
.
32
2.6.4.
"SIMULATED
ANNEALING"
.
33
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
.34
3.1.
EXPRESSIONSSYSTEME,
BAKTERIEN,
PHAGEN
.
34
3.2.
CHEMIKALIEN
UND
GERAETE
.
34
3.3.
NAEHRMEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
35
3.4.
BAKTERIEN
UND
PHAGENANZUCHTEN
.
36
3.4.1.
FERMENTATIONSVORVERSUCHE
MIT
E.COLI
K38
UND
BL21
.
36
3.4.2.
FERMENTATION
VON
E.COLI
K38
.
37
3.4.3.
ANZUCHT
DES
E.COLI
BA-WILDTYP
.
37
3.4.4.
HERSTELLUNG
EINER
T4-PHAGENSUSPENSION
.
37
3.5.
PROTEINISOLIERUNG
.
38
3.5.1.
ARBEITEN
MIT
DER
DNA-CELLULOSE
.
38
3.5.2.
MONO
Q-CHROMATOGRAPHIE:
.
40
3.5.3.
CHROMATOGRAPHIE
AN
BLAUER-SEPHAROSE
.
41
3.5.4.
CHROMATOGRAPHIE
AN
HEPARIN-SEPHAROSE
.
41
3.6.
ABSORPTIONSMESSUNGEN
.
42
3.7.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
43
3.8.
HPLC-GELFILTRATION
.
44
3.9.
VEMETZUNGSEXPERIMENTE
.
44
3.10.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
45
3.10.1.
BESTIMMUNG
MIT
HILFE
DES
MOLAREN
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
.
45
3.10.2.
BESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
46
3.10.3.
BESTIMMUNG
NACH
EHRESMANN
.
46
3.11.
HERKUNFT
VON
BETVL
UND
BETVL
(126-155)
.
46
3.12.
CD-SPEKTROSKOPIE
.
47
3.13.
SEKUNDAERSTRUKTURVORAUSSAGEN
.
48
3.14.
KEMRESONANZSSPEKTROSKOPIE
.
49
3.14.1.
PROBENVORBEREITUNG
.
49
3.14.2.
AUSTAUSCH
DER
AMIDPROTONEN
GEGEN
DEUTERONEN
.
49
3.14.3.
ALLGEMEINE
AUFNAHMEBEDINGUNGEN
.
49
INHALT
III
3.14.4.
LD-LH-NMR-SPEKTREN
.
50
3.14.5.
AUFNAHME
UND
PROZESSIERUNGSPARAMETER
DER
2D-1H-NMR
SPEKTREN
.
51
3.14.6.
HETERONUKLEARE
2D-SPEKTREN
.
51
3.14.7.
3D-SPEKTREN
.
51
3.15.
SEKUNDAERSTRUKTUR-BESTIMMUNG
NACH
WISHART
.
52
3.16.
MOLEKUELDYNAMIK
.
53
3.16.1.
HARD-UND
SOFTWARE
.
53
3.16.2.
EXPERIMENTELLE
DATEN
.
53
3.16.3.
"SIMULATED
ANNEALING"
.
54
3.16.4.
"REFINEMENT"
.
55
3.16.5.
"BACKCALCULATION"
.
55
3.16.6.
STRUKTURINDEX
.
55
3.16.7.
RMSD-WERTE
.
55
3.16.8.
ERSTELLUNG
VON
RAMACHANDRAN-DIAGRAMMEN
.
56
3.16.9.
MOLEKUELDARSTELLUNG
.
56
4.
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
ZU
DSBA
.
57
4.1.
FERMENTATION
.
57
4.1.1.
VORVERSUCHE
.
57
4.1.2.
81-FERMENTATIONEN
.
58
4.2.
PROTEINISOLIERUNG
.
59
4.3.
REINIGUNG
MIT
DNA-CELLULOSE
.
61
4.3.1.
HERSTELLUNG
DER
T4-PHAGENSUSPENSION
.
61
4.3.2.
HERSTELLUNG
DER
DNA-CELLULOSE
.
61
4.3.3.
PROTEINREINIGUNG
MIT
DNA-CELLULOSE
.
61
4.3.4.
MONO
Q-CHROMATOGRAPHIE
.
62
4.3.5.
REINIGUNG
MIT
DER
BLAUEN-SEPHAROSE
.
63
4.3.6.
REINIGUNG
MIT
DER
HEPARIN-SEPHAROSE
.
64
4.4.
NMR-MESSUNGEN
AN
DSBA
.
64
4.4.1.
VARIATION
DER
PUFFERBEDINGUNGEN
.
66
4.4.2.
VARIATION
DER
TEMPERATUR
.
68
4.5.
UV-ABSORPTION
.
69
4.6.
GROESSENBESTIMMUNG
DURCH
GELFILTRATION:
.
70
4.7.
"CROSS-LINKING"-EXPERIMENTE:
.
71
IV
INHALT
5.
ERGEBNISSE
BETVL
.
72
5.1.
CD-SPEKTROSKOPIE
AN
BETVL
.
72
52.
SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGE
.
74
5.3.
NMR-SPEKTROSKOPIE
AN
BETVL
.
74
5.3.1.
EINDIMENSIONALE
LH-NMR-SPEKTREN
.
74
5.3.2.
2D-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
76
5.3.3.
DQF-COSY
.
78
5.3.4.
CLEAN-TOCSY
.
78
5.3.5.
ZUORDNUNG
DER
SPINSYSTEME
.
80
5.3.6.
NOESY-SPEKTREN
UND
SEQUENZSPEZIFISCHE
ZUORDNUNG
.
87
53.7.
ZUORDNUNG
AROMATISCHER
SPINSYSTEME
UNDENDSTAENDIGER
NH
PROTONEN
.
90
5.3.8.
AUSWERTUNG
DER
AH-VERSCHIEBUNG
.
92
5.3.9.
H/D-AUSTAUSCH
.
92
5.3.10.
1H-15N-NMR-SPEKTROSKOPIE
.
95
5.4.
STRUKTURELLE
UNTERSUCHUNGEN
AN
BETVL
(126-155)
.
98
5.4.1.
ERSTE
LD-NMR-MESSUNGEN
.
98
5.4.2.
CD-SPEKTROSKOPIE
AN
BETVL
(126-155)
.
99
5.4.3.
ABSCHLIESSENDE
ID-SPEKTREN
.100
5.5.
2D-NMR-MESSUNGEN
AN
BETVL
(126-155)
.102
5.5.1.
ZUORDNUNG
DER
SPINSYSTEME
.102
5.5.2.
SEQUENZSPEZIFISCHE
ZUORDNUNG
DER
PROTONENRESONANZEN
.104
5.5.3.
INTERRESIDUALE
NOES
.
108
5.5.4.
AUSWERTUNG
DER
AH-VERSCHIEBUNG
.110
5.6.
STRUKTURBERECHNUNG
VON
BETVL
.
111
5.6.1.
BERECHNUNGSZYKLEN
.
111
5.6.2.
QUALITAET
DER
STRUKTUREN
.
112
5.6.3.
HALBQUANTITATIVE
AUSWERTUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTURELEMENTE
.
114
5.6.4.
ERGEBNIS
DER
STRUKTURBERECHNUNG
.
115
5.6.5.
RAMACHANDRAN-DIAGRAMM
.120
INHALT
V
6.
DISKUSSION.
.
.121
6.1.
DSBA
.
121
6.1.1.
REINIGUNG
VON
DSBA
.
121
6.1.2.
NMR-STUDIEN
AN
DSBA
.
123
6.1.3.
URSACHEN
DER
LINIENVERBREITENING
IM
NMR-SPEKTRUM
.
126
6.1.4.
ABSCHLIESSENDE
BEWERTUNG
.
128
6.2.
BETVL
.
129
6.2.1.
SEKUNDAERSTRUKTUR
VON
BETVL
.
129
6.2.2.
NMR-SPEKTROSKOPIE
AM
BETVL
.
130
6.2.3.
DIE
SEQUENZ
126-155
AUS
BETVL
.
133
6.2.4.
WIRKUNG
VON
TRIFLUORETHANOL
(TFE)
AUF
BETVL
(126-155)
.
134
6.23.
DIE
STRUKTUR
VON
BETVL
(126-155)
.
135
6.2.6.
BEWERTUNG
DER
STRUKTUR
VON
BETVL
(126-155)
.
138
6.2.7.
AUSBLICK
.
138
7.
ZUSAMMENFASSUNG
.
139
8.
SUMMARY
.140
9.
LITERATUR
.
141
10.
ABKUERZUNGEN
.
150
11.
ANHANG
.
152
11.1.
ZUR
BERECHNUNG
DER
BETVL
(126-155)-STRUKTUR
VERWENDETE
NOES
.
152
11.1.1.
INTRARESIDUALE
NOES
.152
11.1.2.
INTERRESIDUALE
NOES
.
157
11.2.
X-PLOR-PROTOKOLLE
.
160
11.2.1.
"GENERATE_STRUCTURE.INP"
.
160
11.2.2.
"GENERATE_TEMPLATE.INP"
.
160
11.2.3.
"SA.INP"
.162
11.2.4.
"REFINE.INP"
.164
11.2.5.
"RMSD_WINDOW.INP"
.
166
11.2.6.
"RAMACHANDRAN.INP"
.
168 |
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