Sequenzierung eines Phosphatase-Gens aus Synechococcus PCC7942 sowie teilweise Reinigung und Charakterisierung des Genproduktes:
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| Sprache: | German |
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1994
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| Beschreibung: | Bielefeld, Univ., Diss., 1994 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 INHALTSVERZEICHNIS
1 INHALTSVERZEICHNIS.I
2 ZUSAMMENFASSUNG.-.-.1
3 EINLEITUNG. 3
3.1 CYANOBAKTERIEN.3
3.2 PHOSPHAT: EIGENSCHAFTEN UND FUNKTIONEN.5
3.3 EIGENSCHAFTEN VON PHOSPHATASEN.6
3.3.1 EIGENSCHAFTEN VON ALKALISCHEN PHOSPHATASEN.6
3.3.2 DIE KATALYTISCHE REAKTION VON PHOSPHATASEN.8
3.3.3 AKTIVITAETS-NACHWEIS ALKALISCHER PHOSPHATASEN.10
3.4 FUNKTIONEN VON PHOSPHATASEN .TT.10
3.4.1 EXTRAZELLULAERE PHOSPHATASEN.11
3.4.2 PHOSPHATASEN IM STOFFWECHSEL. 13
3.4.3 PHOSPHOPROTEIN PHOSPHATASEN.15
3.5 VORARBEITEN ZUR
SYNECHOCOCCUS PCC7942-PHOSPHATASE .18
3.5.1 HERSTELLUNG EINER
SYNECHOCOCCUS
PCC7942-GENBANK .18
3.5.2 SCREENING DER GENBANK AUF PHOSPHATASE-AKTIVITAET.19
3.5.3 GENETISCHE VORARBEITEN.20
3.5.4 BIOCHEMISCHE VORARBEITEN.22
3.6 ZIELE DIESER ARBEIT.24
4 MATERIAL UND METHODEN. 25
4.1 BAKTERIENSTAEMME.25
4.2 MEDIEN.26
4.2.1 MEDIEN FUER
SYNECHOCOCCUS
PCC7942.26
4.2.2 MEDIEN FUER
E.COU
.27
4.3 PLASMIDE.
27
4.4 ENZYME.
28
4.4.1 RESTRIKTIONSENZYME.28
4.4.2 ZUSAETZLICHE ENZYME.28
4.5 CHEMIKALIEN UND ZUBEHOER.29
4.6 PUFFER UND LOESUNGEN.30
4.7 COMPUTER UND SOFTWARE.30
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.8 KULTURBEDINGUNGEN.31
4.8.1 ANZUCHT VON
E.COU
.31
4.8.2 ANZUCHT VON
SYNECHOCOCCUS
PCC7942.31
4.9
HERSTELLUNG KOMPETENTER
E.COU
ZELLEN.
32
4.10
TRANSFORMATION KOMPETENTER
E.COU
ZELLEN.
33
4.11
TRANSFORMATION VON
SYNECHOCOCCUS PCC7942.33
4.12 PLASMID-DNA-ISOLIERUNG.34
4.13 GESAMT-DNA-ISOLIERUNG AUS CYANOBAKTERIEN.36
4.14 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN.37
4.15 ETHANOL-PRAEZIPITATION VON DNA.38
4.16 PHOTOMETRISCHE DNA- UND RNA-MENGENBESTIMMUNG.38
4.17 DEPHOSPHORYLIERUNG LINEARER PLASMID-DNA.39
4.18 LIGATION KOHAESIVER DNA-TERMINI.41
4.19
IDENTIFIZIERUNG REKOMBINANTER DNA.
41
4.20 SCREENING VON
E.COU
AUF PHOSPHATASE-AKTIVITAET.42
4.21 CHARAKTERISIERUNG VON DNA.44
4.21.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG.44
4.21.2 AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE.44
4.21.3 AUSWERTUNG VON DNA-AGAROSE-GELEN.45
4.21.4 GROESSENBESTIMMUNG VON DNA-FRAGMENTEN.45
4.22 DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSE-GELEN.46
4.23 DNA LABELING UND DETECTION KIT.46
4.24 EXONUCLEASE III-BEHANDLUNG VON PLASMID-DNA.51
4.25 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA MIT DEM A.L.F.53
4.25.1 ANNEALING DES FLOURESZENZMARKIERTEN PRIMERS.54
4.25.2 DURCHFUEHRUNG DER SEQUENZIERREAKTION.54
4.25.3 VORBEREITEN DER A.L.F.-GELE UND GELLAUF.55
4.26 COMPUTER-SEQUENZANALYSE VON DNA UND PROTEIN.57
4.26.1 KODIERBEREICHSANALYSE NACH STADEN: ANALYSEQ.57
4.26.2 HOMOLOGIESTUDIEN NACH LIPMAN UND PEARSON: FASTA.57
4.26.3
DNA- UND PROTEIN-UNTERSUCHUNGEN MIT PC/GENE
.58
4.27 ISOLIERUNG VON GESAMT-PROTEIN AUS
E.COU
.58
4.28 PROTEINREINIGUNGSMETHODEN
59
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.28.1 ISOLIERUNG PERIPU\SMATISCHER PROTEINE.59
4.28.2 AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERUNG.59
4.28.3 DIALYSE. 60
4.28.4 SAEULENCHROMATOGRAPHIE.60
4.29 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON PROTEIN.61
4.29.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD.62
4.29.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH SMITH.62
4.30 AKTIVITAETMESSUNGEN MIT EINER ALKALISCHEN PHOSPHATASE . 63
4.31 SDS-POLYACRYLAMID-GEL ELEKTROPHORESE.67
5 ERGEBNISSE . 71
5.1 SUBKLONIERUNG DES PHOSPHATASE-GENS.71
5.T.1 ERWEITERUNG DER
PKWL -RESTRIKTIONSKARTE.71
5.1.2 EINGRENZUNG DES PHOSPHATASE KODIERENDEN BEREICHS.72
5.2 SEQUENZIERUNG EINES AUSGEWAEHLTEN DNA-FRAGMENTS.73
5.2.1 KONSTRUKTION VON SUBKLONE FUER-DIE EXO-BEHANDLUNG.73
5.2.2 KONSTRUKTION SEQUENZIERGEEIGNETER EXO-KLONE.75
5.3 SEQUENZANALYSE. 77
5.3.1 OFFENE LESERASTER (ORFS).77
5.3.2 ZEIGT DIE PHOSPHATASE-SEQUENZ EINE TRANSMEMBRANE HELIX ?.82
5.3.3 SUCHE NACH MOEGLICHEN N-GLYKOSIDISCHEN BINDUNGSSTELLEN .83
5.3.4 SUCHE NACH MOEGLICHEN PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN.83
5.3.5 SEKUNDAERSTRUKTUR DER PHOSPHATASE.84
5.3.6 PROKARYONTISCHE, SEKRETORISCHE SIGNALSEOUENZ.85
5.3.7 AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG.85
5.3.8 DER ISOELEKTRISCHE PUNKT.85
5.3.9 HYDORPATHIEPLOT.86
5.3.10 HOMOLOGIEN.86
5.4 INSERTIONSINAKTIVIERUNG DES PHOSPHATASE-GENS.89
5.4.1 HYBRIDISIERUNG DER
SYNECHOCOCCUS
PCC7942 UND
SYNECHOCOCCUS
PCC6301 GESAMT-DNA MIT DEM
MARKIERTEN PKW14-LNSERT.89
5.4.2 CM
R-INAKTIVIERUNG DES PHOSPHATASE-GENS.90
5.4.3 IST EINE INAKTIVIERUNG IN
SYNECHOCOCCUS
PCC7942 MOEGLICH? .92
5.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOSPHATASE-AKTIVITAET.92
5.5.1 DER EINFLUB VON TRITON X-100 AUF DIE PHOSPHATASE-AKTIVITAET.92
5.5.2 ABHAENGIGKEIT DER PHOSPHATASE-AKTIVITAET VON DER
INKUBATIONS-DAUER MIT TRITON X-100.94
5.6 PHOSPHATASE-AKTIVITAET IN ABHAENGIGKEIT VERSCHIEDENER
WACHSTUMSBEDINGUNGEN.95
IN
INHALTSVERZEICHNIS
5.7 KANN DIE PHOSPHATASE-EXPRESSION IN
E.COU
DURCH
GENETISCHE MANIPULATION GESTEIGERT WERDEN?.97
5.8 TEILWEISE REINIGUNG DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE.98
5.8.1 LOKALISATION DER PHOSPHATASE IN
E.COU
CC118/PKW1.98
5.8.2 VORVERSUCHE FUER DIE TEILWEISE REINIGUNG DER ALKALISCHEN
PHOSPHATASE AUS
E.COU
CC118.100
5.8.3 SCHEMA FUER EINE TEILWEISE REINIGUNG DER ALKALISCHEN
SYNECHOCOCCUS
PCC7942-PHOSPHATASE AUS
E.COU
.101
5.9 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PHOSPHATASE.106
5.9.1 BESTIMMUNG DES PH-OPTIMUMS.106
5.9.2 TEMPERATUROPTIMUM DER PHOSPHATASE.107
5.9.3 TEMPERATURSTABILITAET DER PHOSPHATASE.108
5.9.4 SUBSTRATSPEZIFITAET DER PHOSPHATASE.109
5.9.5 EINFLUSS MOEGLICHER HEMMSTOFFE.110
5.9.6 IST AUCH LINEARISIERTE DNA EIN SUBSTRAT?.115
6 DISKUSSION. 116
6.1 SUBKLONIERUNG DES PHOSPHATASE-GENS.116
6.2 SEQUENZIERUNG DES AUSGEWAEHLTEN DNA-FRAGMENTS.117
6.3 SEQUENZANALYSE.118
6.4 INSERTIONSINAKTIVIERUNG DES PHOSPHATASE-GENS.124
6.5 ERHOEHUNG DER PHOSPHATASE-AKTIVITAET.124
6.6 EXPRESSIONSRATEN DER PHOSPHATASE.125
6.7 DIE EXPRESSION KANN NICHT WEITER GESTEIGERT WERDEN.126
6.8 TEILWEISE REINIGUNG DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE.126
6.9 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PHOSPHATASE.128
6.10 DIE PHOSPHATASE ALS GENTECHNISCHES HILFSMITTEL?.131
6.11
ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNGEN
.131
6.12 WEITERFUEHRENDE ARBEITEN.134
7 LITERATUR.135
8 ANHANG.144
9 DANKSAGUNG. .149
IV |
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