Das Proteasom aus Thermoplasma acidophilum: Primärstruktur der beiden Untereinheiten, funktionelle Expression in Escherichia coli und Untersuchungen zur Assemblierung
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
ZUSAMMENFASSUNG
1
B.
EINLEITUNG
3
C.
MATERIAL
UND
METHODEN
11
1.
MATERIAL
11
1.1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
MEDIEN
11
1.2.
PLASMIDE
11
1.3.
ENZYME
11
1.4.
OLIGONUKLEOTIDE
12
1.5.
CHEMIKALIEN
UND
ANDERE
MATERIALIEN
12
2.
METHODEN
12
2.1.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
12
2.1.1.
REINIGUNG
VON
PROTEASOMEN
AUS
T.
ACIDOPHILUM
12
2.1.2.
PROTEINSEQUENZIERUNG
DER
PROTEASOMALEN
UNTEREINHEITEN
13
2.1.3.
EXPRESSION
PROTEASOMALER
GENE
IN
E.
COZI-BL21(DE3)
14
2.1.4.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEASOMEN
14
2.1.5.
REINIGUNG
VON
A-RINGEN
14
2.1.6.
ANREICHERUNG
DER
AA2-34-UNTEREINHEITEN
15
2.1.7.
ANREICHERUNG
DER
MUTIERTEN
AE25P-UNTEREINHEITEN
15
2.1.8.
REINIGUNG
DER
MONOMEREN
SS-UNTEREINHEITEN
15
2.1.9.
ANREICHERUNG
DER
SSAPRO-UNTEREINHEITEN
15
2.1.10.
SAEULENCHROMATOGRAPHIEN
16
2.1.11.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
16
2.1.12.
WESTERN-BLOT
17
2.1.13.
BESTIMMUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
17
2.1.14.
PROTEINBESTIMMUNG
_
17
2.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
18
2.2.1.
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNS
18
2.2.2.
SOUTHERN-TRANSFER
18
2.2.3.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
18
2.2.4.
HYBRIDISIERUNG
18
2.2.5.
ISOLIERUNG VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
19
2.2.6.
5'-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-ENDEN
19
2.2.7.
LIGATION
19
2.2.8.
TRANSFORMATION
19
2.2.9.
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
19
2.2.10.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
20
II
2.2.11.
DNS-SEQUENZIERUNG
20
2.2.12.
GERICHTETE
MUTATION
DER
PROTEASOMALEN
GENE
20
2.3.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
21
2.4.
COMPUTERANALYSEN
21
D.
ERGEBNISSE
23
1.
PROTEINTEILSEQUENZEN
DER
UNTEREINHEITEN
DES
PROTEASOMS
23
1.1.
TEILSEQUENZEN
DER
A-UNTEREINHEIT
23
1.2.
TEILSEQUENZEN
DER
SS-UNTEREINHEIT
25
2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
GENE
25
2.1.
A-GEN
26
2.2.
SS-GEN
28
2.3.
ANALYSE
DER
SEQUENZ
DER
A
UND DER
SS-UNTEREINHEIT
28
3.
PROTEIN
UND
DNS-SEQUENZVERGLEICHE
30
3.1.
VERGLEICH
DER
BEIDEN
ARCHAEBAKTERIELLEN
UNTEREINHEITEN
30
3.2.
VERGLEICH
DER
KODIERENDEN
SEQUENZEN
DES
A
UND
SS-GENS
31
3.3.
VERGLEICH
DER
ARCHAEBAKTERIELLEN
MIT
EUKARYONTISCHEN
PROTEASOMALEN
UNTEREINHEITEN
33
3.4.
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
A
UND
SS-UNTEREINHEIT
MIT
DATENBANKEN
40
4.
EXPRESSION
PROTEASOMALER
GENE
IN
E.
COZI-BL21(DE3)
41
4.1.
EXPRESSION
VON
FUNKTIONELLEN
PROTEASOMEN
42
4.2.
EXPRESSION
VON
A-RINGEN
45
4.3.
EXPRESSION
VON
MUTIERTEN
A-UNTEREINHEITEN
47
4.4.
EXPRESSION
DER
MONOMEREN
SS-UNTEREINHEIT
49
4.5.
EXPRESSION
EINER
MUTIERTEN
SS-UNTEREINHEIT
51
4.6.
COEXPRESSION
DER
SSAPRO
UND
DER
A-UNTEREINHEIT
53
E.
DISKUSSION
57
1.
DIE
PRIMAERSTRUKTUR
DES
THERMOPLASMA
PROTEASOMS
57
2.
POSTTRANSLATIONALE
PROZESSIERUNG
VON
SS-TYP-UNTEREINHEITEN
58
3.
DIE
PROTEIN-SUPERFAMILIE
DER
PROTEASOMALEN
UNTEREINHEITEN
58
4.
PROTEASOMEN
IN
BACTERIA?
59
5.
EVOLUTION
DER
PROTEASOMEN
60
6.
VERGLEICH
VON
PROTEASOMEN
UND
CHAPERONINEN
60
7.
ANTIGEN-PROZESSIERUNG
DURCH
IMMUNOPROTEASOMEN
61
8.
SYNTHESE
VON
REKOMBINANTEN
PROTEASOMEN
IN
E.
COLI
62
9.
SYNTHESE
VON
A-RINGEN
IN
E.
COLI
62
10.
SYNTHESE
VON
SS-UNTEREINHEITEN
MIT
UND
OHNE
PROPEPTID
63
11.
AUSBLICK
64
F.
LITERATURVERZEICHNIS
67
ABKUERZUNGEN
82 |
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