Die sekretierte saure Phosphatase von Leishmania mexicana - molekulare Charakterisierung eines polymeren Enzyms:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
KRANKHEIT
UND
ERREGER
.
1
1.2.
GENOMISCHE
ORGANISATION,
TRANSKRIPTION
UND
GENETISCHE
MANIPULIERBARKEIT
.
6
1.3.
DIE
OBERFLAECHE
UND
SEKRETORISCHEN
PRODUKTE
VON
LEISHMANIEN
.
9
1.4.
DIE
LYSOSOMALE
SAURE
PHOSPHATASE
.
16
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
.
17
2.
MATERIALIEN
.
18
2.1.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
18
2.2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
18
2.3.
MEDIEN
.
19
2.4.
LEISHMANIA
SPEZIES
.
20
2.5.
BAKTERIENSTAEMME
(
COLI)
.
20
2.6.
OLIGONUKLEOTIDE
.21
2.7.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.21
3.
METHODEN
.
22
3.1.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
22
3.1.1.
N-CHLORSUCCINIMID
SPALTUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
22
3.1.2.
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.22
3.1.3.
PROTEINBESTIMMUNG
.
23
3.1.4.
AUFKONZENTRATION
VON
KULTURUEBERSTAENDEN
.
23
3.1.5.
BESTIMMUNG
DER
PHOSPHATASE-AKTIVITAET
.
23
3.2.
IMMUNCHEMISCHE
METHODEN
.
24
3.2.1.
ELISA
.
24
3.2.2.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
25
3.2.3.
IMMUNOBLOT
.
25
3.2.4.
IMMUNFLUORESZENZ
.
26
3.2.5.
IMMUNISIERUNG
EINES
KANINCHENS
MIT
LAP
.
27
3.2.6.
REINIGUNG
VON
ANTI-LAP
POLYKLONALEM
ANTISERUM
.
27
3.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
29
3.3.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
29
3.3.1.1.
PLASMID-DNA:
.
29
3.3.1.2.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
LEISHMANIEN:
.
30
3.3.1.3.
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
LEISHMANIEN:
.
30
3.3.2.
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
31
3.3.3.
NUKLEINSAEURE-MARKIERUNG
.
31
3.3.4.
HYBRIDISIERUNGSANALYSE
.31
3.3.5.
UNTERSUCHUNG
EINER
GENOMISCHEN
DNA
BANK
.
32
3.3.6.
DNA
SEQUENZANALYSE
.
32
3.3.7.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
33
3.3.8.
WEITERE
MOLEKULAITOIOLOGISCHE
METHODEN
.
33
3.4.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
33
3.4.1.
KULTUR
VON
PROMASTIGOTEN
.
33
3.4.2.
ISOLIERUNG
VON
AMASTIGOTEN
.
33
3.4.3.
TRANSFEKTION
VON
LEISHMANIEN
.
34
3.4.4.
INFEKTION
VON
MAKROPHAGEN
MIT
PROMASTIGOTEN
.
34
3.4.5.
INFEKTION
VON
MAEUSEN
.
35
3.4.6.
LANGZEITLAGERUNG
VON
LEISHMANIEN
.
35
4.
ERGEBNISSE
.
36
4.1.
DIE
SEKRETIERTE
SAURE
PHOSPHATASE
(SAP)
.
36
4.1.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
36
4.1.2.
TRANSKRIPTION
DER
IMSAP
GENE
.
44
4.1.3.
NACHWEIS
VON
IMSAP
GENEN
IN
ANDEREN
LEISHMANIA
SPEZIES
.
46
4.1.4.
BESTIMMUNG
DES
EPITOPS
FUER
DEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
LT8.2
.
47
4.1.5.
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
.
49
4.1.6.
ANALYSE
DER
DELETIONSMUTANTEN
.
56
4.1.6.1.
ZUORDNUNG
DER
GENE
ZU
DEN
PROTEINKOMPONENTEN
IM
SAP-KOMPLEX
.56
4.1.6.2.
INFEKTION
VON
MAKROPHAGEN
UND
MAEUSEN
MIT
DEN
SAP
DELETIONSMUTANTEN
.
57
4.1.7.
EXPRESSION
VON
IMSAP!
UND
IMSAP2
'M
LEISHMANIA
MAJOR
.
59
4.1.8.
0-GLYCOSYLIERUNGSDOMAENEN
DER
SEKRETIERTEN
SAUREN
PHOSPHATASE
.
62
4.2.
DIE
LYSOSOMALE
SAURE
PHOSPHATASE
(LAP)
.
70
4.2.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
70
4.2.2.
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
VON
LAP
.
73
4.2.3.
UEBEREXPRESSION
VON
IMLAP
IN
LEISHMANIA
MEXICANA
.
76
5.
DISKUSSION
.
80
5.1.
KLASSIFIZIERUNG
VON
LAP
UND
SAP
.
80
5.2.
SORTIERUNG
IN
DER
ZELLE
.
83
5.3.
MODELL
ZUR
ENTSTEHUNG
DER
REPETITIVEN
REGION
VON
SAP2
.
86
5.4.
GENREGULATION
IN
LEISHMANIEN
.
89
5.5.
DIE
DELETIONSMUTANTEN
.
92
5.6.
0-GLYCOSYLIERUNGEN
DER
SAP-PROTEINE
.
94
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
97
7.
ANHANG
.
100
7.1.
'CODON-USAGE'
TABELLE
.
100
7.2.
PLASMIDKARTEN
.
102
7.2.1.
ALLGEMEINE
PLASMIDE
.
102
7.2.2.
PBLUESCRIPTLL
SK(+)
MIT
DNA
AUS
LEISHMANIEN
.
103
7.2.3.
PLASMIDE
ZUR
HERSTELLUNG
VON
LAP-SAP-FUSIONSPROTEINEN
.
104
7.2.4.
EXPRESSIONSPLASMIDE
FUER
LAP
UND
DEREN
VORSTUFEN
.
106
7.2.5.
WEITERE
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
107
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
108 |
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