Genregulation in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster: Analyse der Promoterregion von Mst87F
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| Format: | Buch |
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
1
IL
MATERIAL
UND
METHODEN
6
1.
ABKUERZUNGEN
6
2.
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
8
3.
VEKTOREN
UND
BAKTERIENSTAEMME
8
4.
MOLEKULARGEWICHTS-STANDARDS
8
5.
OLIGONUKLEOTIDE
9
6.
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
10
7.
AUFZUCHT
UND
GENETISCHE
KONSTITUTION
DER
VERWENDETEN
FLIEGENSTAEMME
11
8.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
11
8.1.
ISOLIERUNG
MIT
"FREEZE-SQUEEZE"
12
8.2.
FRAGMENTISOLIERUNG
MIT
DEAE-NA45-MEMBRAN
12
8.3.
FRAGMENTISOLIERUNG DURCH
ELEKTROELUTION
12
8.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
"LOW
MELTING"-AGAROSE
13
9.
EINFACHE
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
13
9.1.
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
13
9.2.
PHOSPHORYLIERUNG
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
13
9.3.
AUFIUELLREAKTION
MIT
DEM
KLENOW-FRAGMENT
DER
DNA-POLYMERASE
I
14
9.4.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
14
10.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
15
10.1.
HERSTELLUNG
LAGERFAEHIGER,
KOMPETENTER
ZELLEN
15
10.2.
TRANSFORMTION
15
11.
PLASMID-DNA-PRAEPARATION
16
11.1.
PLASMID-DNA-MINIPRAEPARATION
16
11.2.
PLASMID-DNA-PRAEPARATION
IN
GROSSEM
MASSSTAB
16
12.
DNA-SEQUENZIERUNG
IN
PLASMIDEN
16
12.1.
SEQUENZIERUNGSREAKTION
16
12.2.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELE
ZUR
DNA-SEQUENZIERUNG
17
13.
POLYMERASEKETTENREAKTION
MIT
PLASMID-DNA
18
14.
TRANSFORMATION
VON
DROSOPHILA
MELANOGASTER
18
15.
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
IN
GANZEN
ORGANEN
VON
DROSOPHILA
MELANOGASTER
20
16.
DNA-ISOLIERUNG
AUS
ADULTEN TIEREN
20
17.
"SOUTHENT-ANALYSE
21
18.
IN
WFRO-TRANSKRIPTION
21
19.
FILTERHYBRIDISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
22
20.
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
23
20.1.
ISOLATION
VON
PROTEINEN
AUS
DROSOPHILA
MELANOGASTER
ORGANEN
23
20.2.
ISOLATION
NUKLEAERER
PROTEINE
23
20.3.
ISOLATION
VON
PROTEINEN
AUS
ZELLKULTUREN
23
21.
PROTEINBESTIMMUNG
24
22.
DNA-VERZOEGERUNGSGELELEKTROPHORESE
(EMSA)
24
22.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
22.1.1.
MARKIERUNG
DES
5'-ENDES
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
24
22.1.2.
AUFFIILLEN
VON
3'ZURUECKLIEGENDEN
ENDEN
MIT
KLENOW-FRAGMENT
UND
A-32P-DATP
25
22
2.
AUFREINIGUNG
ENDMARKIERTER
DNA-FRAGMENTE
25
22.2.1.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UEBER
SEPHADEX G-25
25
22.2.2.
REINIGUNG
DURCH
ISOLIERUNG
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
25
22.3.
BINDUNGSREAKTION
UND
GELELEKTROPHORESE
26
23.
GELFILTRATION
27
HL
ERGEBNISSE
28
A.
ANALYSE
DER
PROMOTORREGION
VON
MST87F
DURCH
TRANSFORMATIONSEXPERIMENTE
28
1.
KONSTRUKTE
DER
AA757A-PROMOTORREGION
VON
-102
BIS
+201
28
1.1.
KONSTRUKTION
VON
-1
02/+201
OHNE
INTRON
28
1.2.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
31
1.3.
KONSTRUKTION
VON-102/+201
MIT
INTRON
32
1.4
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
32
1.5.
KONSTRUKTION
VON
-102
BIS
+47
33
1.6.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
34
2.
KONSTRUKTE
ZUM
TRANSKRIPTIONSSTART
VON
MSL87F
36
2.1.
KONSTRUKTION
VON-5/+47
36
2.2.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
36
2.2.1
"SOUTHEM"-ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
38
2.3.
KONSTRUKTION
VON-20/+20
40
2.4.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
40
2.5.
KONSTRUKTION
VON
-20/+20-TCE
41
2.6.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
42
3.
KONSTRUKTE
AUS
MST87F
UND/2-7UBI/ZFN-PROMOTORREGION
44
3.1.
DIE
AFS/S7F-REGION
-102
BIS
-8
UND
DAS
TCE
\MSS2-TUBULIN-GEU
44
3.2.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
45
3.3.
DIE
A/S/S7F'-REGION-102
BIS
-38
VOR
DEMJ82-7ZZZ !//IZI-GEN
46
3.4.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFONNATIONSLINIEN
47
3.5.
DAS
TCE
IMSS2-TUBULIN-GEA
48
3.6.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
48
3.7.
DAS
TCE
IM
SS2-TUBVLIN-KONSTXUKT
OHNE
"SS2LBL"
50
3.8.
P-ELEMENT-TRANSFORMATION
DES
KONSTRUKTES
UND
ANALYSE
DER
TRANSFORMATIONSLINIEN
50
B.
DNA-PROTEIN-INTERAKTIONEN
DES
TCE
53
1.
"EMSA"
MIT
VERSCHIEDENEN
BEREICHEN
DER
MSL8
7F
PROMOTORREGION
53
2.
NACHWEIS
DER
SPEZIFITAET
DER
BINDUNGSAKTIVITAET
DURCH
KOMPETITION
57
3.
DER
TCE-BINDENDE
FAKTOR
IN
VERSCHIEDENEN
PROTEINEXTRAKTEN
59
4.
SEQUENZSPEZIFITAET
DER
TCE-BINDUNG
60
5.
ERSTER
SCHRITT
ZUR
AUFREINIGUNG
DES
TCE-FAKTORS:
GELFILTRATION
62
IV.
DISKUSSION
65
A.
IDENTIFIZIERUNG
REGULATORISCHER
ELEMENTE
IN
DER
PROMOTORREGION
VON
MST87F
65
1.
INTRONSEQUENZEN
ENTHALTEN
KEINE
REGULATORISCHEN
ELEMENTE
66
2.
DAS
AFR/SZF-FRAGMENT
-102/+47
ENTHAELT
ALLE
INFORMATIONEN
FUER
DIE
GEWEBE
UND
STADIENSPEZIFISCHE
EXPRESSION
66
3.
HAT
MST87F
EIN
INITIATOR-ELEMENT?
67
4.
SPERMATOCYTENSPEZIFISCHE
EXPRESSION
WIRD
DURCH
VERSCHIEDENE
UNABHAENGIGE
PROMOTORELEMENTE
GESTEUERT
68
B.
NACHWEIS
DER
TRANS-FAKTOREN
70
1.
DAS
TCE
IST
EINE
ZIELSEQUENZ
FUER
EIN
DNA-BINDENDES
PROTEIN
70
2.
DAS
TCE-BINDENDE
PROTEIN
IST
UBIQUITAER
70
3.
DIE
KONSERVIERUNG
DER
TCE-SEQUENZ
IST
FUER
EINE
EFFEKTIVE
BINDUNG
ESSENTIELL
71
4.
AUFREINIGUNG
DES
TCE-BINDENDEN
PROTEINS
72
V.
ZUSAMMENFASSUNG
73
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
74 |
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