Glutathionreduktase in malignen Tumoren und Malariaparasiten: Beiträge zur Expression und Charakterisierung des Enzyms
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1993
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| Beschreibung: | Heidelberg, Univ., Diss., 1995 (Nicht für den Austausch) |
| Beschreibung: | 77 Bl. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN
1. EINLEITUNG 1
1.1.
DAS FLAVOENZYM GLUTATHIONREDUKTASE 1
1.2.
OXIDATIVER STRESS 4
1.3.
DIE GLUTATHIONREDUKTASE IN TUMORZELLEN 6
1.3.1. BEDEUTUNG DER GR FUER DIE ZELLPROLIFERATION 6
1.3.2. GLUTATHION-METABOLISMUS UND MULTI-DRUG-RESISTANCE 6
1.4.
DIE GLUTATHIONREDUKTASE DES MALARIAPARASITEN
PLASMODIUM FALCIPARUM 9
1.4.1. MALARIA _ 9
1.4.2. OXIDATIVER STRESS IN DER WIRT-PARASIT-BEZIEHUNG 12
1.4.3. OXIDATIVER STRESS IN DER THERAPIE DER MALARIA TROPICA 14
1.5.
PROBLEMSTELLUNG 15
2.
MATERIAL UND METHODEN
16
2.1.
GERAETE, REAGENTIEN, GEWEBE UND ZELLEN 16
2.1.1. GERAETE 16
2.1.2. SAEULENMATERIALIEN 16
2.1.3. CHEMIKALIEN 16
2.1.4. ENZYME 17
2.1.5. GEWEBE UND ZELLEN 18
2.1.6. BAKTERIENSTAEMME 18
2.1.7.
MEMBRANEN UND FILMMATERIAL
18
2.2.
PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN 19
2.2.1. PUFFER UND LOESUNGEN 19
2.2.2. MEDIEN 21
2.3.
BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN
22
2.3.1. GLUTATHIONREDUKTASE-ASSAY 22
2.3.2. GLUTAMATDEHYDROGENASE-ASSAY 22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.4.
BESTIMMUNG DER PROTEIN- UND HB-KONZENTRATION 23
2.4.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH WARBURG UND CHRISTIAN 23
2.4.2. BCA-METHODE 23
2.4.3. BESTIMMUNG DER HAEMOGLOBINKONZENTRATION 24
2.5.
CELLULOSEACETATGEL-ELEKTROPHORESE (CELLOGEL) 24
2.5.1. ENZYMATISCHER GLUTATHIONREDUKTASENACHWEIS 24
2.5.2. GSH-FAERBUNG NACH KAPLAN 25
2.5.3. NADPH-FAERBUNG NACH VAN SOMEREN 25
2.6.
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 26
2.6.1. COOMASSIE-FAERBUNG 27
2.6.2. SILBEMITRAT-FAERBUNG 27
2.6.3. WESTERN BLOT 27
2.7.
REINIGUNG DER GLUTATHIONREDUKTASE AUS P. FALCIPARUM
28
2.7.1. IMMUNADSORPTIONSCHRORIIATOGRAPHIE
AN ANTI-HGR-PROTEIN A-SEPHAROSE 28
2.7.2. AFFMITAETSCHROMATOGRAPHIE AN 2'5'-ADP-SEPHAROSE 4B 29
2.7.3. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AN Q-SEPHAROSE 29
2.7.4. PRAEPARATIVE SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 29
2.8.
AUFARBEITUNG VON GEWEBEPROBEN UND TUMORZELLINIEN 30
2.8.1. SIMULTANE ISOLATION VON RNA UND DNA 30
2.8.2. PROTEIN-EXTRAKTION 32
2.9.
ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN 32
2.9.1. FORMALDEHYD-AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON RNA 32
2.9.2. AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA 33
2.10.
TRANSFER VON RNA UND DNA AUF NYLON-MEMBRANEN 33
2.11. HERSTELLUNG 32P-MARKIERTER DNA-SONDEN 34
2.12.
HYBRIDISIERUNG MIT 32P-MARKIERTEN DNA-SONDEN 35
2.13. TRANSFORMATION VON E.CO/I-ZELLEN MIT PLASMID-DNA 35
2.13.1. RBCL-METHODE NACH HANAHAN 35
2.13.2. ELEKTROTRANSFORMATION 36
2.14.
TEST AUF PLASMODIUM /A/CIPARIIM-GIUTATHIONREDUKTASE-
AKTIVITAET IN TRANSFORMIERTEN FS.CO/I-KOLONIEN
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
38
3.1. UNTERSUCHUNG DER GLUTATHIONREDUKTASE-GENEXPRESSION
IN PROLIFERIERENDEN ZELLEN 38
3.1.1. TRANSKRIPTE DES GR-GENS IN HELA- UND EAT-ZELLINIEN 38
3.1.2. GR-EXPRESSION IN EXPERIMENTALTUMORZELLINIEN DER MAUS 40
3.1.3. GR-EXPRESSION IN MENSCHLICHEN HAUTTUMORZELLINIEN 41
3.1.4. GR-EXPRESSION IN MENSCHLICHEN LUNGENTUMORGEWEBEN 43
3.1.4.1. GENOMISCHE ORGANISATION DES GR-GENS 43
3.1.4.2. VERGLEICH DER GR-MRNA-SPIEGEL 45
3.1.4.3. ENZYMAKTIVITAET DER GR 47
3.1.5. SYNOPSIS 48
3.1.6. AUSBLICK 49
3.2. DIE GLUTATHIONREDUKTASE AUS
PLASMODIUM FALCIPARUM
50
3.2.1. REINIGUNG DER GLUTATHIONREDUKTASE AUS
PLASMODIUM FALCIPARUM
(PFGR) 50
3.2.1.1. ROHEXTRAKT 50
3.2.1.2. IMMUNADSORPTIONSCHROMATOGRAPHIE 51
3.2.1.3. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 51
3.2.1.4. ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 51
3.2.2. K
M-WERT DER PFGR FUER NADPH 53
3.2.3. TRENNUNG VON PFGR UND HGR IM CELLULOSEACETAT-GEL 54
3.2.4. IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNG IM WESTERN BLOT 58
3.2.5. VERSUCH DER BESTIMMUNG DER N-TERMINALEN SEQUENZ
DER PFGR 59
3.2.6. VERSUCH DER KLONIERUNG DES
PFGR
GENS DURCH
KOMPLEMENTATION IN
E. COLI
59
3.2.7. AUSBLICK 61
4. ZUSAMMENFASSUNG 62
5. LITERATURVERZEICHNIS
65
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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