Enzymatische Analyse von Oberflächenglykanen auf intakten Zellen mittels fluoreszenter Sialinsäuren und Zytometrie:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1. ABKUERZUNGEN.7
2. EINLEITUNG.8
2.1. DIE BIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON ZUCKERSTRUKTUREN AUF DER ZELL
OBERFLAECHE.8
2.2. DIE OBERFLAECHENGLYKANE DES ERYTHROZYTEN ALS MODELL.10
2.2.1. DIE GLYKOPHORINE.11
2.2.2. BANDE 3 UND BANDE 4.5.13
2.3. SIALINSAEUREN ALS ENDSTAENDIGE ZUCKER AUF OBERFLAECHENGLYKANEN.17
3. ZIELSETZUNG DER ARBEIT.18
4. MATERIAL UND METHODIK.21
4.1. FEINCHEMIKALIEN UND REAGENZIEN.21
4.2. VERWENDETE ENZYME.21
4.3. VERWENDETE PUFFER.22
4.4. DIE ERYTHROZYTEN.24
4.4.1. HERKUNFT DER ERYTHROZYTEN.24
4.4.2. LAGERUNG DER ERYTHROZYTEN.25
4.4.3. BESTIMMUNG DER ZEITZAHL.25
4.5. DIE ENZYMATISCHE MARKIERUNG VON OBERFLAECHENGLYKA
NEN INTAKTER ERYTHROZYTEN MIT FLUORESZENTER SIALINSAEURE.25
4.5.1. DIE SIALYLTRANSFERASEN.26
4.5.2. DIE DONOR-SUBSTRATE.27
4.5.3. DIE ERYTHROZYTEN ALS AKZEPTOREN.27
4.5.4. WEITERE SUBSTANZEN IM INKUBATIONSANSATZ UND REFERENZEN.28
4.6. GEZIELTE MODIFIKATION DER SIALYLTRANSFERASE-AKZEP-
TOREN AUF DER OBERFLAECHE INTAKTER ERYTHROZYTEN.28
4.6.1. VORBEHANDLUNG DER ERYTHROZYTENOBERFLAECHE MIT
SIALIDASEN.28
4.6.2. SIALIDASE-BEHANDLUNG DER ERYTHROZYTEN SI
MULTAN ZUR SIALYLIERUNG.29
4.6.3. VORBEHANDLUNG DER ERYTHROZYTENOBERFLAECHE MIT
GALACTOSIDASEN.30
4.6.4. VORBEHANDLUNG DER ERYTHROZYTENOBERFLAECHE MIT PAPAIN.30
4.6.5. GALACTOSYLIERUNG DER ERYTHROZYTEN MIT SS1,4-GALACTOSYL-
TRANSFERASE UND UDP-GALACTOSE.31
-I-
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.7. ENZYMATISCHE NACHSPALTUNGEN DER FLUORESZENT-MAR
KIERTEN ERYTHROZYTENOBERFLAECHE AN INTAKTEN ZELLEN.31
4.7.1. NACHSPALTUNGEN MIT SIALIDASEN.31
4.7.2. NACHSPALTUNGEN MIT ENDO-SS-GALACTOSIDASE.31
4.7.3. NACHSPALTUNGEN MIT N-GLYCOPEPTIDASE F.32
4.7.4. NACHSPALTUNGEN MIT TRYPSIN.32
4.8. ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN IM ZELLYSAT UND AN MEMBRANPRAE
PARATIONEN.32
4.9. DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG DER AUF DIE ERYTHROZYTEN UEBER
TRAGENEN FLUORESZENZ.33
4.9.1. PRINZIPIEN DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE.33
4.9.2. MESSUNG DER FLUORESZENT-MARKIERTEN ERYTHROZYTEN.35
4.10. GELCHROMATOGRAPHISCHE MESSUNG DER MAKROMOLEKULAR GEBUNDE
NEN FLUORESZENZ NACH ZELLYSIS.38
4.10.1. MESSPRINZIP UND MESSVORSCHRIFT.38
4.10.2. EICHUNG DER DUNCHFLUSSZYTOMETER.38
4.11. MEMBRANPRAEPARATION UND WESTEM-BLOT DER ELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTEN GLYKOPROTEINE.39
5. ERGEBNISSE.
41
5.1. DIE SIALYLIERUNG NATIVER ERYTHROZYTEN.41
5.1.1. DIE SIALYLIERUNG ADULTER ERYTHROZYTEN MIT
A2,6-SIALYLTRANSFERASE ALS GRUNDVERSUCH.41
5.1.2. DIE SIALYLIERBARKEIT VON NABELSCHNURERY
THROZYTEN MIT A2,6-SIALYLTRANSFERASE.46
5.1.3. DIE SIALYLIERUNG ADULTER ERYTHROZYTEN MIT
A2,3-SIALYLTRANSFERASE.
47
5.1.4 DIE SIALYLIERBARKEIT VON NABELSCHNURERY
THROZYTEN MIT A2,3-SIALYLTRANSFERASE.48
5.1.5. A2,3- UND A2,6-SIALYLTRANSFERASE SIMULTAN
IN EINEM SIALYLIERUNGSASSAY.50
5.2. SIALYLIERUNG UND SIALIDASESPALTUNG.50
5.2.1. A2,6-SIALYLIERUNG VON ERYTHROZYTEN NACH VORBEHANDLUNG MIT
SIALIDASE AUS ARTHROBACTER UREAFACIENS BZW. VIBRIO CHOLERAE.51
5.2.2. A2,6-SIALYLIERUNG VON ERYTHROZYTEN NACH VORBEHANDLUNG MIT
SIALIDASE AUS SALMONELLA FYPNMURIUM.52
5.2.3. A2,3-SIALYLIERUNG VON ERYTHROZYTEN NACH VORBEHANDLUNG MIT
ARTHROBACTER UREAFACIENS
BZW. VIBRIO CHOLERAE SIALIDASE.53
5.2.4. SIALIDASE-NACHSPALTUNG VON FLUORESZENT-MARKIERTEN ERYTHRO
ZYTEN.54
5.3. SIALYLIERUNG UND NACHSPALTUNG MIT N-GLYCOPEPTIDASE F.54
5.4. SIALYLIERBARKEIT DER ERYTHROZYTEN NACH
SS-GALACTOSIDASE-BEHANDLUNG.55
-II-
5.5. SIALYLIERUNG UND ENDO-SS-GALACTOSIDASE-SPALTUNG.55
5.5.1. SIALYLIERBARKEIT DER ERYTHROZYTEN NACH -
ENDO-SS-GALACTOSIDASE-BEHANDLUNG.56
5.5.2. ENDO-SS-GALACTOSIDASE-NACHSPALTUNGEN VON
FLUORESZENT-MARKIERTEN ERYTHROZYTEN.57
5.6. SIALYLIERUNG UND TRYPSINBEHANDLUNG.59
5.7. GALACTOSYLIERUNGSVERSUCHE.61
3.7. SYNTHETISCHE SIALINSAEURE ALS EPITOP IM WESTEM-BLOT.61
6. DISKUSSION.
65
6.1. METHODISCHE ASPEKTE DER ARBEIT.65
6.1.1. GRUNDZUEGE DER ENZYMATISCHEN GLYKANANALYSE.65
6.1.2. METHODEN ZUR ANALYSE FLUORESZENT-MARKIERTER
GLYKOKONJUGATE.66
6.1.3. ENZYMATISCHE SIALYLIERUNG VON ERYTHROZYTEN.68
6.1.4. CHARAKTERISIERUNG DER SUBSTRATSPEZIFITAET VON
A2,3- UND A2,6-SIALYLTRANSFERASE.71
6.2. BIOLOGISCHE ASPEKTE DER ARBEIT.75
6.2.1. UNTERSCHIEDE IN DER NATUERLICHE SIALYLIERUNG UM-
BILIKALER UND ADULTER ERYTHROZYTEN.75
6.2.2. UNTERSCHIEDE IN DER EXPRESSION ENDSTAENDIGER
N-ACETYLGLUCOSAMINYL-RESTE.76
6.2.3. QUANTITATIVE EXPRESSION VON KOMPLEX- UND POLYLAKTOSAMIN-
TYPGLYKANEN AUF UMBILIKALEN UND ADULTEN ERYTHROZYTEN.76
6.2.4. WEITERE ANALYTISCHE FOLGERUNGEN FUER DIE TERMINALEN ZUCKER
STRUKTUREN VON UMBILIKALEN UND ADULTEN ERYTHROZYTEN.77
6.3. AUSBLICK.'
7
7. ZUSAMMENFASSUNG.60
8. LITERATUR.2
9. LEBENSLAUF.
99
10. DANKSAGUNG.
100
-III- |
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