Die Rolle eines 80-kDa-Protein bei der Assemblierung des mitochondrialen Atmungsketten-Komplex I von N. crassa:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
3
ZI
DIE
OXIDATIVE
PHOSPHORYLIERUNG
DER
MITOCHONDRIEN
3
Z2
DIE
PROTONENPUMPENDE
NADHTUBICHINON
OXIDOREDUKTASE
(KOMPLEX
I)
5
2.3
ASSEMBLIERUNG
VON
KOMPLEX
I
10
2.4
DAS
GENERELLE
KONZEPT
MOLEKULARER
CHAPERONE
13
2.5
THEMA
DER
ARBEIT
14
3
MATERIAL
UND
METHODEN
16
3.1
CHEMIKALIEN,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
16
3.2
MIKROORGANISMEN
UND
VEKTOREN
18
3.3
ZUCHT
UND
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
N.CRASSA
19
3.4
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
ZWISCHENSTUFEN
DER
ASSEMBLIERUNG
VON
KOMPLEX
I
20
3.5
ISOLIERUNG
DER
GROSSEN
MEMBRANARMVORSTUFE
VON
KOMPLEX
I
21
3.6
VERSCHIEDENE
PROTEINCHEMISCHE,
ENZYMATISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
22
3.6.1
PROTEINBESTIMMUNG
22
3.6.2
NADH-HEXACYANOFERRAT
REDOXAKTIVITAET
23
3.6.3
SDS-GELELEKTROPHORESE
23
3.6.4
ELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-POLYACRYAMIDGELEN
23
3.6.5
TRANSFER DER
PROTEINE
AUF
MEMBRANEN
24
3.6.6
BRCN-SPALTUNG
DES
84
KDA-PROTEINS
25
3
6.7
SEQUENZIERUNG
BRCN-FRAGMENTE
DES
80
KDA
PROTEIN
25
3.6.8
HERSTELLUNG
POLYVALENTER
ANTISEREN
25
3.6.9
SYNTHESE
VON
SYNTHETISCHEN
PEPTIDEN
26
3.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
27
3.7.1
DIE
ZUCHT
VON
E.COH
UND
LAMMA-PHAGEN
27
3.7.2
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
28
3
7.3
ISOLATION
VON
PHAGEN-DNA
28
3.7.4
ISOLATION
GENOMISCHER
DNA
29
3.7.5
ISOLATION
VON
RNA
29
3.7.6
MRNA
ISOLATION
30
3.7.7
PLASMIDPRAEPARATIONEN
30
3.7.8
RESTRIKTION
VON
DNA
31
3.7.9
FRAGMENTISOLATION
31
3.7.10
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
31
3
7.11
HERSTELLUNG
VON
SUBKLONEN
32
3.7.12
SEQUENZIERUNG VON
DNA
32
3.7.13
SOUTHERN
(NORTHERN)
BLOT
ANALYSE
32
3.7.14
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
33
3.7.15
SEQUENZANALYSE
33
3.7.16
SYNTHESE
UND
REINIGUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN
34
3.7.17
DNA-AMPLIFIZIENTNG
DURCH
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
34
4
ERGEBNISSE
36
4.1
NACHWEIS
VON
KOMPLEX
I-VORSTUFEN
DURCH
PULSE-CHASE
MARKIERUNG
VON
N.CRASSA
WILDTYP
36
4.1.1
MARKIERUNG
EINER
UNBEHANDELTEN
KULTUR
36
4.2
MARKIERUNG
EINER
CHLORAMPHENICOL-BEHANDELTEN
KULTUR
38
4.2.1
MARKIERUNG
EINER
CYCLOHEXIMID-BEHANDELTEN
KULTUR
40
4.3
ANHAEUFUNG
DER
MEMBRANARM-VORSTUFEN
VON
KOMPLEX
I
IN
DER
N.CRASSA
MUTANTE
NUO21
42
4.4
ISOLIERUNG
DER
GROSSEN
MEMBRANARM-VORSTUFE
DES
KOMPLEX
I
AUS
DER
MUTANTE
NUO21
46
4.5
ISOLATION
DES
80
KDA
EXTRA-PROTEIN
AUS
DER
GROSSEN
MEMBRANARM-VORSTUFE
VON
KOMPLEX
I
51
4.5.1
ISOLIERUNG
DURCH
PRAEPARATIVE
SDS/PAGE
DER
GROSSEN
MEMBRANARM-VORSTUFE
51
4.5.2
ISOLIERUNG
DURCH
HAMSTOFIBEHANDLUNG
DER
GROSSEN
MEMBRANARM-VORSTUFE
52
4.6
AMINOSUEURESEQUENZIERUNG
DES
80
KDA
PROTEINS
54
4.7
ANTIKOERPER
GEGEN
DAS
80
KDA
PROTEIN
FUELLEN
NUR
DIE
GROSSE
MEMBRANARM-VORSTUFE
VON
KOMPLEX
I
55
4.8
KEINE
REAKTION
DES
80
KDA
PROTEIN
MIT
ANTIKOERPERN
GEGEN
HSP60
UND
HSP
70
57
4.9
KLONIERUNG
DES
GENS
DES
80
KDA
PROTEINS
60
5
DISKUSSION
64
5.1
DIE
GROSSE
MEMBRANARMVORSTUFE
VON
KOMPLEX
I
64
5.2
ISOLIERUNG
DER
GROSSEN
MEMBRANARMVORSTUFE
UND
DES
80
KDA
PROTEIN
64
5.3
DAS
80
KDA
PROTEIN
65
5.4
IST
DAS
80
KDA
PROTEIN
EIN
MOLEKULARES
CHAPERONE?
66
5.5
WELCHE
FUNKTION
KONNTE
DAS
80
KDA
BEI
DER
ASSEMBLIERUNG
VON
KOMPLEX
I
BESITZEN
?
68
5.6
PROBLEME
DER
KLONIERUNG
DES
80
KDA
PROTEINS
69
5.7
DIE
ASSEMBLIERUNG
DES
KOMPLEX
I
71
6
AUSBLICK
73
7
LITERATUR
74 |
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