Untersuchungen zur Stabilität der Quartärstruktur von Phosphofructokinase-1 aus Saccharomyces-cerevisiae-Mutanten:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 1995 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 9
2.1. MATERIALIEN 9
2.1.1. CHEMIKALIEN, ENZYME, ANTIKOERPER 9
2.1.2. LOESUNGEN UND PUFFER 9
2.1.3. HEFE-UND BAKTERIENSTAEMME 9
2.1.3.1. HEFESTAEMME (
SACCHAROMYCES CEREVISIAE) 9
2.1.3.2. BAKTERIEN STAEMME
(ESCHERICHIA COLI) 11
2.1.4. PLASMIDE 11
2.2. METHODEN 11
2.2.1. ZELLTECHNIKEN 11
2.2.1.1. ZELLKULTIVIERUNG UND STAMMHALTUNG 11
2.2.1.2. MEDIEN FUER DIE ZELLZUCHT 12
2.2.1.3. KREUZUNG VON HEFESTAEMMEN 14
2.2.1.4. SPORULATION UND MASSENSPORENANALYSE 14
2.2.1.5. STABILITAETSTEST 14
2.2.1.6. ZELLAUFSCHLUSS DURCH GLASPERLEN 15
2.2.2. METHODEN IN DER NUKLEINSAEUREANALYTIK 15
2.2.2.1. STERILISIERUNG 15
2.2.2.2. DNA-EXTRAKTION DURCH ORGANISCHE LOESUNGSMITTEL 15
2.2.2.3. DNA-FAELLUNG 16
2.2.2.4. QUANTITATIVE DNA-BESTIMMUNG 16
2.2.2.5. RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 16
2.2.2.6. AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA 17
2.2.2.7. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 17
2.2.2.8. MODIFIKATION UND LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 18
2.2.2.9. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI DURCH SCHNELLPRAEPARATION 19
2.2.2.10. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI MIT DEM "QIAGEN"-KIT 20
2.2.2.11. ISOLIERUNG VON CHROMOSOMALER DNA AUS SACCHAROMYCES CEREVISIAE
20
2.2.2.12. COMPUTERGESTUETZTE SEQUENZANALYSE 21
2.2.3. ZELLTRANSFORMATIONEN 21
2.2.3.1. TRANSFORMATION VON
E. COLI 21
2.2.3.2. TRANSFORMATION VON
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 22
2.2.4. DELETION VON GENEN IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 24
2.2.5. SOUTHEM-BLOT-ANALYSE 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.5.1. DIGOXIGENIN-MARKIERUNG VON DNA-PROBEN 24
2.2.5.2. DNA-TRANSFER AUF NYLONMEMBRANEN 25
2.2.5.3. HYBRIDISIERUNG 26
2.2.5.4. ENZYM-IMMUNOASSAY ZUM NACHWEIS HYBRIDISIERTER PROBEN 27
2.2.6. BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-1 28
(EC 2.7.1.11.)
2.2.6.1. AKTIVITAETSMESSUNG 28
2.2.6.2. MATHEMATISCHE AUSWERTUNG DER KINETISCHEN DATEN 29
2.2.7. PROTEINANALYTIK 29
2.2.7.1. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 29
2.2.7.2. POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE IN GEGENWART VON SDS 30
2.2.7.3. GELFILTRATION MIT EINEM FPLC-SYSTEM 32
2.2.8. WESTERN-BLOT-ANALYSE 32
2.2.8.1. PROTEIN-TRANSFER AUF NITROCELLULOSEMEMBRANEN 32
2.2.8.2. NACHWEIS DER PFK-1-UNTEREINHEITEN DURCH ENZYM-IMMUNOASSAY 33
2.2.8.3. SLOT-BLOT-ANALYSE 34
3. ERGEBNISSE 35
3.1. DELETION DES PFK1 -GENS IN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE ENY1A 35
3.1.1. KONSTRUKTION DER PFK1-DELETION 35
3.1.2. EINFUEHREN DER DELETION INS HEFE-GENOM 36
3.1.3. KONTROLLE DER TRANSFORMANDEN 38
3.2. CHARAKTERISIERUNG DER PFK1-DELETIONSMUTANTE 41
3.2.1. PHOSPHOFRUCTOKINASE-1-AKTIVITAET 41
3.2.2. WACHSTUM 46
3.2.3. IDENTIFIZIERUNG VON PFK-1-UNTEREINHEITEN DURCH
WESTEM-BLOT-ANALYSE 47
3.2.4. MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG VON PFK-1 DURCH FPLC-GELFILTRATION 48
3.2.5. KOMPLEMENTATION DER PFK-1-AKTIVITAET 50
3.3. DELETION DES MUTANTENALLELS PFKL-1 AUS
SACCHAROMYCES CEREVISIAE 52
DFY70
3.3.1. EINKREUZEN DES MUTANTENALLELS PFKL-1 IN EINEN URACIL-AUXOTROPHEN
52
STAMMHINTERGRUND
3.3.2. DELETION DES PFKL-L-ALLELS IN DMY70-28 54
3.4. BEEINFLUSSUNG DER PFK-L-AKTIVITAET IN DMY4E DURCH C-TERMINAL 57
DELETIERTE A-UNTEREINHEITEN
3.4.1. KONSTRUKTION 3'-TERMINAL DELETIERTER PFK1-GENE 57
3.4.2. TRANSFORMATION 3'-TERMINAL DELETIERTER PFKL-GENE IN DMY4E 63
3.4.3. PFK-1-AKTIVITAET IN DMY4E NACH TRANSFORMATION 3'-TERMINAL 65
DELETIERTER PFK 1-GENE
3.5. UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION DES N-TERMINUS DER A-UNTEREINHEIT 67
3.5.1. KONSTRUKTION EINER N-TERMINAL DELETIERTEN A-UNTEREINHEIT 67
3.5.2. EXPRESSION DER N-TERMINAL DELETIERTEN A-UNTEREINHEIT IN DMY4E 69
3.5.3. CHARAKTERISIERUNG DER PFK-1-AKTIVITAET IN DMY4E PKOIII 70
4. DISKUSSION 73
5. ZUSAMMENFASSUNG 86
6. LITERATURVERZEICHNIS 89
ANHANG |
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