Reinigung und Charakterisierung von ESBP: ein E2F-Sequenz-bindendes-Protein aus Saccharomyces cerevisiae
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1-16
1.1
1.1.1
1.1.2
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
E2F
1
E2F
-
EINE
WACHSENDE
GENFAMILIE
1
E2F-BINDUNGSSTELLEN
UND
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
IN
DER
3
GL
/S
PHASE
DER
ZELLZYKLUS
1.1.3
1.1.4
REGULATION
DER
E2F
AKTIVITAET
5
E2F
ALS
ZENTRALER
REGULATOR
FUER
DEN
EINTRITT
IN
DIE
S
PHASE
10
1.2
ZELLZYKLUS-REGULIERTE
TRANSKRIPTION
IN
DER
HEFE
10
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
1.2.1
1.2.2
1.2.3
DER
GL/S
KONTROLLPUNKT
(START)
IN
S.
CEREVISIAE
11
TRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
DER
GL
CYCLIN/CDK
AKTIVITAET
11
KOORDINIERTE
EXPRESSION
VON
GENEN,
DIE
FUER
DIE
DNA-SYNTHESE
13
NOETIG
SIND
1.2.4
EVOLUTIONAERE
KONSERVIERUNG
ZELLZYKLUS-SPEZIFISCHER
14
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
1.3
AUFGABENSTELLUNG
16
2
MATERIAL
17-21
2.1
BAKTERIENSTAEMME
17
2.2
HEFESTAEMME
17
2.3
PLASMIDE
18
2.4
ENZYME
18
2.5
CHEMIKALIEN,
GERAETE
UND
ANDERE
MATERIALIEN
18
2.6
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
21
3
METHODEN
22-62
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
BAKTERIENKULTUREN
22
ANZUCHT
AUF
AGARPLATTEN
22
VERMEHRUNG
IN
FLUESSIGKULTUREN
22
STAMMHALTUNG
22
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
HEFEKULTUREN
22
ANZUCHT
AUF
AGARPLATTEN
22
VERMEHRUNG
IN
FLUESSIGKULTUREN
23
STAMMHALTUNG
23
A-FAKTOR-SYNCHRONISATION
VON
HEFEKULTUREN
24
MESSUNG
DES
DNA-GEHALTS
VON
HEFEN
IM
FACS
24
3.3
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
E.COLI
25
3.3.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COLI
25
3.3.2
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
VEKTOREN
25
3.3.3
TRANSFORMATION
EINES
LIGASEANSATZES
25
3.3.4
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
26
3.3.5
PLASMIDISOLIERUNG
UEBER
SCHNELLAUFSCHLUSS
27
3.3.6
PLASMIDISOLIERUNG
UEBER
QIAGEN-SAEULEN
27
3.4
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
HEFE
28
3.4.1
TRANSFORMATION
VON
HEFEN
NACH
ITO
28
3.4.2
TRANSFORMATION
VON
HEFEN
NACH
SCHIESTL
UND
GIETZ
28
3.4.3
ELEKTROPORATION
VON
HEFEN
30
3.4.4
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
HEFEN
30
3.4.5
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
HEFEN
31
3.4.6
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
HEFEN
31
3.4.7
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFEN
32
3.4.8
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
VON
TRANSFORMIERTEN
HEFEN
32
3.5
DURCHMUSTERN
VON
GENBANKEN
34
3.5.1
HERSTELLUNG
PHAGENKOMPETENTER
BAKTERIEN
34
3.5.2
TITERBESTIMMUNG
34
3.5.3
FILTERABZUEGE
UND
-HYBRIDISIERUNG
34
3.5.4
ISOLIERUNG
EINES
EINZELPLAQUES
35
3.5.5
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
35
3.5.6
ANLEGEN
VON
PHAGENSTOCKLOESUNGEN
36
3.5.7
IN
VIVO
EXZISION
VON
XZAPII-PHAGEMIDEN
36
3.6
PROTEINEXTRAKTE
AUS
HEFEN
37
3.6.1
AUFSCHLUSS
DURCH
ZYMOLYASE
37
3.6.2
AUFSCHLUSS
MIT
DEM
HOMOGENISATOR
37
3.6.3
AUFSCHLUSS
MIT
GLASPERLEN
38
3.7
PROTEINREINIGUNG
38
3.7.1
DEAE-SEPHAROSE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
38
3.7.2
BIOREX
70
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
39
3.7.3
PHENYL-SEPHAROSE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
39
3.7.4
HEPARIN-SEPHAROSE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
40
3.7.5
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
(STREPTAVIDIN-BIOTIN-KOPPLUNG)
40
3.7.5.1
OLIGONUKLEOTID-LIGATION
41
3.7.5.2
BIOTIN-MARKIERUNG
41
3.7.5.3
KOPPLUNG
AN
STREPTAVIDINAGAROSE
42
3.7.5.4
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
STREPTAVIDIN-DYNABEADSYY
42
3.75.5
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
42
3.7.6
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
(BRCN-KOPPLUNG)
43
3.7.7
GELFILTRATION
44
3.8
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
45
3.8.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
45
3.8.2
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
FAELLUNG
45
3.8.3
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
45
3.8.3.1
LAEMMLI-GELE
45
3.8.3.2
TRICIN-GELE
46
3.8.4
COOMASSIEFAERBUNG
47
3.8.5
SILBERFAERBUNG
47
3.8.6
RENATURIERUNG
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-GELEN
47
3.8.7
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-GELEN
48
3.8.8
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
PAA-GELEN
49
3.9
DNA-PROTEINKOMPLEXE
49
3.9.1
GELRETENTION
IN
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
49
3.10
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
50
3.10.1
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLETIDE
UEBER
PAA-HARNSTOFFGELE
50
3.10.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
50
3.10.3
ASSOZIIERUNG
KOMPLEMENTAERER
OLIGONUKLEOTIDSTRAENGE
50
3.10.4
REINIGUNG
DRUCH
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOL-PRAEZIPITATION
51
3.10.5
REINIGUNG
UEBER
SEPHADEX
G50
SAEULEN
51
3.10.6
DNA-ISOLIERUNG
AUS
GELSTUECKEN
DURCH
ISOTACHOPHORESE
51
3.10.7
DNA-ISOLIERUNG
AUS
GELSTUECKEN
DURCH
ELEKTROELUTION
52
3.10.8
DNA-ISOLIERUNG
AUS
GELSTUECKEN
DURCH
AUSZENTRIFUGIEREN
52
3.11
ANALYSE
UND
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
UND
RNA
53
3.11.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA
DURCH
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
53
3.11.2
AUFTRENNUNG
VON
RNA
UEBER
DENATURIERENDE
AGAROSEGELE
53
3.11.3
AUFTRENNUNG
VON
HEFE-CHROMOSOMEN
DURCH
PULSFELD
GELELEKTROPHORESE
53
3.11.4
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
54
3.11.5
ABSPALTUNG
VON
5'-PHOSPHATEN
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
54
3.11.6
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-ENDEN
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
54
3.11.7
HERSTELLUNG
GLATTER
ENDEN
DURCH
T4-DNA-POLYMERASE
55
3.11.8
DELETIONEN
DURCH
BAL
31-EXONUCLEASE
55
3.11.9
DELETIONEN
DURCH
EXONUKLEASELLL
56
3.11.10
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
56
3.12
BLOTTING
UND
HYBRIDISIERUNGS-VERFAHREN
FUER
DNA
UND
RNA
57
3.12.1
SOUTHERN-BLOT
57
3.12.2
NORTHERN-BLOT
58
3.12.3
FILTERHYBRIDISIERUNG
IN
FORMAMID-PUFFER
58
3.12.4
FILTERHYBRIDISIERUNG
IN
"CHURCH'-PUFFER
59
3.12.5
NICHTRADIOAKTIVE
FILTERHYBRIDISIERUNG
MIT
DEM
ECL-SYSTEM
59
3.12.6
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
60
3.13
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
61
3.13.1
MARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA-FRAGMENTE
61
3.13.2
5'-ENDMARKIERUNG
MIT
T4
POLYNUKLEOTIDKINASE
61
3.13.3
MARKIERUNG
5'-UEBERHAENGENDER
ENDEN
MIT
TAQ-POLYMERASE
61
3.13.4
MARKIERUNG
5'-UEBERHAENGENDER
ENDEN
MIT
KLENOW-POLYMERASE
61
3.13.5
KARTIERUNG
DES
5'-ENDES
VON
RNA-MOLEKUELEN
62
4
ERGEBNISSE
_
63-108
4.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
AMINOSAEURE-PERMEASE
64
GENS
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
4.1.1
KLONIERUNG
EINER
PUTATIVEN
AMINOSAEURE-PERMEASE
VON
64
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
4.1.2
SEQUENZANALYSE
UND
PRIMAERSTRUKTUR
DES
PAPI
-GENS
65
4.1.3
VERWANDTSCHAFT
VON
PAPI
ZU
BEKANNTEN
AMINOSAEURE-PERMEASEN
66
4.1.4
BESTIMMUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES
DER
PAPL-MRNA
71
4.1.5
GENOMISCHE
ORGANISATION
DER
PAPI-GENREGION
73
4.2
DURCH
E2F-BINDUNGSSTELLEN
VERMITTELTE
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
74
IN
S.
CEREVISIAE
4.2.1
KONSTRUKTION
DER
REPORTERPLASMIDE
75
4.2.2
TRANSAKTIVIERUNGS-EXPERIMENTE
IN
VIVO
76
4.2.3
POTENTIELLE
ESBP-BINDUNGSSTELLEN
IN
S.
CEREVISIAE
PROMOTOR
77
SEQUENZEN
4.3
REINIGUNG
VON
ESBP
AUS
S.
CEREVISIAE
79
4.3.1
DEAE-SEPHAROSE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
79
4.3.2
BIOREX
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
81
4.3.3
HEPARIN-SEPHAROSE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
83
4.3.4
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
84
4.3.4.1
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
AN
SAEULENMATERIALIEN
85
4.3.4.2
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
AN
DYNABEADSYY
86
4.3.5
ANALYSE
DES
AFFINITAETSGEREINIGTEN
ESBP-PROTEINS
87
4.3.6
ELEKTROELUTION
VON
ESBP
AUS
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
88
4.3.7
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
VON
ESBP
89
4.4 CHARAKTERISIERUNG
DES
E2F-ERKENNUNGSSEQUENZ
BINDENDEN
90
PROTEINS
ESBP
AUS
S.
CEREVISIAE
4.4.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINGROESSE
90
4.4.1.1
RENATURIERUNG
VON
ESBP
AUS
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
90
4.4.1.2
ISOLIERUNG
VON
ESBP
AUS
EINEM
PRAEPARATIVEN
RETENTIONSGEL
92
4.4.1.3
BESTIMMUNG
DER
PROTEINGROESSE
VON
ESBP
DURCH
GELFILTRATION
93
4.4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNGS-SPEZIFITAET
UND
-AFFINITAET
VON
ESBP
95
4.4.2.1
BINDUNGSSPEZIFITAET
IM
GELRETENTIONSEXPERIMENT
95
4.4.2.2
EINFLUSS
VON
SALZEN
AUF
DIE
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
VON
ESBP
97
4.4.2.3
EINFLUSS
DER
TEMPERATUR
AUF
DIE
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
VON
ESBP
98
4.4.2.4
BESTIMMUNG
DES
K
O
FF-WERTES
VON
ESBP
100
4.4.2.5
BESTIMMUNG
DER
GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN
VON
ESBP
AN
VERSCHIEDENE
BINDUNGSSTELLEN
102
4.4.3
ESBP
BESITZT
KEINE
SWI4-KOMPONENTE
104
4.4.4
ZELLZYKLUSREGULATION
DER
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
VON
ESBP
105
4.4.4.1
A-FAKTOR-SYNCHRONISATION
VON
5.
CEREUISINE-KULTUREN
106
4.4.4.2
ESBP
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
WAEHREND
DES
ZELLZYKLUS
107
$
DISKUSSION
109-119
5.1
E2F-BINDUNGSSTELLEN
VERMITTELN
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
IN
110
S.
CEREVISIAE
5.2
ESBP
UND
SEINE
BIOCHEMISCHEN
EIGENSCHAFTEN
112
5.3
ESBP,
REINIGUNG
EINES
DNA-BINDENDEN
PROTEINS
116
6
_
ZUSAMMENFASSUNG
120-121
7
ANHANG
122-123
7.1
7.1.1
7.1.2
UEBERSICHT
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
122
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
KLONIERUNG
VON
PAPI
122
ZUR
KARTIERUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTS
VERWENDETES
122
OLIGONUKLEOTID
7.1.3
7.1.4
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
SEQUENZREAKTIONEN
122
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
GELRETENTIONEN
UND
AKTIVIERUNGSEXPERIMENTE
122
8
LITERATURVERZ
EIC
HNIS
_
124-133 |
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