ESR-Untersuchungen an Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase von Kaninchenskelettmuskel und dem hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus woesei:
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1994
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1
INHALTSVERZEICHNIS
:
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
2
1.
EINLEITUNG
4
2.
DIE
GLYCERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE
(GAPDH)
6
2.1.
EINFUEHRUNG
6
2.2.
DIE
STRUKTUR
DER
GAPDH
8
2.3.
DIE
KOOPERATIVITAET
DER
COENZYMBINDUNG
DER
GAPDH
9
2.4.
STABILITAET UND AKTIVITAET
DER
GAPDH
11
2.5.
DIE
GAPDH
DES
HYPERTHERMOPHILEN
ARCHAEBAKTERIUM
PYROCOCCUS
WOESEI
13
2.5.1.
ALLGEMEINES
13
2.5.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
14
2.6.
STRUKTUR
UND
BIOCHEMISCHE
FUNKTION
VON
SS-NICOTINAMID-ADENIN-DINUKLEOTID
(NAD
+
)
16
2.7.
DIE
ADP-RIBOSYLIERUNG
DER
GAPDH
18
3.
DIE
LACTAT-DEHYDROGENASE
(LDH)
21
4.
DIE
ELEKTONENSPIN-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE
(ESR)
24
4.1.
PHYSIKALISCHE
GRUNDLAGEN
26
4.2.
DIE
HYPERFEIN-WECHSELWIRKUNG
30
4.3.
DIE
ANISOTROPIE
DER
NITROXIDRADIKALE
32
4.4.
ANWENDUNG
VON
SPINMARKIERTEN
COENZYMANALOGA
35
4.4.1.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
SPIN-LABEL-NUKLEOTID-ANALOGA
39
4.4.2.
PHOTOAFFINITY-LABELING MIT
NUKLEOTIDANALOGA
41
5.
PROBLEMSTELLUNG
42
2
6.
ERGEBNISSE
44
6.1.
ISOLIERUNG
DER
GAPDH
VON
KANINCHENSKELETTMUSKEL
NACH
EINER
EFFIZIENTEREN
METHODE
44
6.2.
ISOLIERUNG
DER
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
UND
DARSTELLUNG
DES
APOENZYMS
45
6.3.
ESR-BINDUNGSSTUDIEN
AN
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
UND
AUS
P.
WOESEI
46
6.3.1.
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
8-SL-NAD+
UND
N
6
-SL-NAD
+
AN
GAPDH
VON
KANINCHENMUSKEL
UND
P.
WOESEI
46
6.3.2.
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
8-SL-ATP
AN
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
UND
P.
WOESEI
47
6.3.3.
INHIBITION
DER
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
DURCH
ATP
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
NAD
+
-KONZENTRATION
57
6.3.4.
BINDUNG
DES
PHOTAFFINITY-SPIN-LABEL-COENZYMANALOGONS
2-N3-N
6
-ATP
AN
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
60
6.4.
VERSUCHE
ZUM
NACHWEIS
EINER
STICKSTOFFMONOXID-STIMULIERTEN
ADP-RIBOSYLIERUNG AN
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
UND
P.
WOESEI,
SOWIE
DER
LACTAT-DEHYDROGENASE
(LDH)
63
6.4.1.
ASSAYS
MIT
SDS-PAGE-GEL-/AUTORADIOGRAMM-NACHWEIS
63
6.4.2.
ESR-SPEKTROSKOPISCHE
EXPERIMENTE
MIT
NITROPRUSSIDNATRIUM
UND
SL-ATP
UND
SL-NAD+
AN
GAPDH
AUS
KANINCHEN
UNDP.
WOESEI
69
6.4.3.
AKTIVITAETS-ASSAYS
MIT
SICKSTOFFMONOXID
AN
DER
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
UND
P.
WOESEI
72
6.5.
VERSUCH
ZUR
SYNTHESE
VON
NICOTINAMID-N
6
-(2,
2,6,6,
-TETRA
METHYLPIPERIDIN
1
-OXYL-4-YL)-SS-ADENIN-DINUKLEOTID
(N
6
-SL-NAD
+
)
MITTELS
EINER
VEREINFACHTEN
REAKTIONSFIIHNMG
74
7.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
78
3
8.
EXPERIMENTELLER
TEIL
81
8.1.
SYNTHESE
VON
NICOTINAMID-N
6
-(2,2,6,6,-TETRAMETHYLPIPERIDIN
1
-
OXYL-4-YL)-SS-ADENIN-DINUCLEOTID
(N
6
-SL-NAD
+
)
NACH
EINER
MODIFIZIERTEN
HAUSVORSCHRIFT
VON
GOODIE
81
8.1.1.
SYNTHESE
VON
N
6
-SL-ADENOSIN
81
8.1.2.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
N
6
-SL-ADENOSIN
81
8.1.3.
KOPPLUNG
MIT
NICOTINAMIDMONONUCLEOTID
(NMN)
81
8.2.
ENZYMATISCHE
ARBEITEN
82
8.2.1.
ISOLIERUNG
DER
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
MITTELS
EINER
EFFIZIENTEREN
VORSCHRIFT
82
8.2.2.
DARSTELLUNG
DES
APOENZYMS
DER
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
83
8.2.3.
ISOLIERUNG
DER
GAPDH
DES
ARCHAEBAKTERIUM
P.
WOESEI
83
8.2.3.1.
ISOLIERUNG
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
GAPDH
VON
P.
WOESEI
AUSE.
COLI
DES
STAMMES
K12
83
8.2.3.2.
DARSTELLUNG
DES
APOENZYMS
DER
GAPDH
VON
P.
WOESEI
84
8.2.4.
GLUCOSE-6-PHOSPHAT-TEST
ZUM
NACHWEIS
VON
NADP+
85
8.2.5.
GEKOPPELTE
SDS-PAGE-/AUTORADIOGRAMM-ASSAYS
86
8.2.6.
QUANTIFIZIERUNG
DES
NO-STIMULIERTEN
EINBAUS
VON
[
32
P]
NAD
+
/-NAD
+
-FRAGMENTEN
IN
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
VON
PYROCOCCUS
WOESEI
87
8.2.7.
PROTEINBESTIMMUNGEN
88
8.2.8.
AKTIVITAETSTEST
MIT
DER
GAPDH
AUS
KANINCHENMUSKEL
88
8.2.9.
AKTIVITAETSTEST
MIT
DER
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
90
8.2.10.
HEMMUNG
DER
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
DURCH
ATP
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
NAD+-KONZENTRATION
90
8.2.11.
KONZENTRIERUNG
UND
UMPUFFEM
DER
GAPDH
AUS
P.
WOESEI
MITTELS
CENTRICON
91
8.2.12.
GELZENTRIFUGATION
DER
PROTEIN/COENZYMKOMPLEXE
91
4
8.2.13.
HERSTELLUNG
VON
GLYCERINYLDEHYD-3-PHOSPHAT
(GAP)
AUS
DEM
MONOBARIUMSALZ
92
.3.
ALLGEMEINES
92
8.3.1.
ESR-MESSUNGEN
92
8.3.2.
UV-MESSUNGEN
93
8.3.3.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
93
8.3.4.
BESTRAHLUNG
93
8.3.5.
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
93
8.3.6.
ZENTRIFUGATION
94
8.3.7.
GEFRIERTROCKNUNG
94
8.3.8.
ULTRASCHALL
94
8.3.9.
CHEMIKALIEN
94
LITERATURVERZEICHNIS
95 |
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