Regulation des Plasminogenaktivator-Inhibitors-2 (PAI-2) durch den Dioxin-Rezeptor:
Gespeichert in:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DER
AH-REZEPTOR
2
1.2
TOXISCHE
UND
BIOLOGISCHE
WIRKUNGEN
VON
TCDD
5
1.3
DIE
LEBER
ALS
ZIELORGAN
DER
TCDD-WIRKUNG
8
1.4
DERPLASMINOGENAKTIVATOR-INHIBITOR-2
11
1.5
DIE
ZEUINIE
U-937
14
2.
AUFGABENSTELLUNG
15
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
16
3.1
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
16
3.2
GERAETE
UND
MATERIALIEN
17
3.3
LOESUNGEN,
NAEHRMEDIEN,
PUFFER
20
3.4
ZELLKULTUR
24
3.4.1
KULTURBEDINGUNGEN
UND
BEHANDLUNG
DER
ZELLEN
24
3.4.2
TRYPSINIEREN
DER
ZELLEN
25
3.4.3
STERILES
EINFRIEREN
DER
ZELLEN
25
3.4.4
STERILES
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
26
3.4.5
KOLLAGENBESCHICHTUNG
DER
PETRISCHALEN
26
3.4.6
PRIMAERKULTUREN
UND
PERMANENTZELLINIEN
26
3.4.6.1
PRIMAERHEPATOZYTEN
DER
RATTE
26
3.4.6.2
PRIMAERKULTUR
VON
KUPFFER-ZENDOTHELZELLEN
DER
RATTENLEBER
27
3.4.6.3
PRIMAERHEPATOZYTEN
DES
MENSCHEN
27
3.4.64
HEPG2-ZELLEN
28
3.4.6
5
U-937-ZELLEN
29
3.5
VERSUCHSTIERE
29
3.6.
ISOLIERUNG
VON
ZELLEN
AUS
DER
RATTENLEBER
30
3.6.1
GEWINNUNG
VON
PRIMAERHEPATOZYTEN
30
3.6.1.1
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
30
3.6.1.2
BESTIMMUNG
DER
VITALITAET
31
3.6.2
GEWINNUNG
VON
NICHTPARENCHYMALEN
LEBERZELLEN
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
31
3.6.2.1
PEROXIDASE-FAERBUNG
33
3.6.3
GEWINNURUZ
VON
ENDOTHEL
UND
KUNFFERZELLEN
DURCH
ELUTRIATION
33
3.7
SYNTHESE
EINER
SPEZIFISCHEN
PAI-2-SONDE
FUER
DIE
RATTE
35
3
7.1
SEQUENZVERGLEICH
PAI-2
RATTE
UND
PAI-2
MENSCH
35
3.7
2
SYNTHESE
DER
PAI-2-SONDE
FUER
DIE
RATTE
MIT
HILFE
DER
PCR
37
3.7.3
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
HB
101
MIT
PLASMIDEN
39
3.7.4
PLASMIDVERMEHRUNG
UND
REINIGUNG
40
3.7.5
PLASMIDVERDAU
DURCH
SCHNEIDEN
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
AM
BEISPIEL
DES
PAI-2
41
3.7.6
ISOLIERUNG
DER
CDNA
AUS
DEM
SOFTAGAR
42
3
8
RNA-ISOLIERUNG
43
3.8.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
43
3.8.2
ISOLIERUNG
VON
POLY
A"-RNA
43
3.8.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
RNA
UND
DNA
45
3.9
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
45
3.9.1
RNA-GELELEKTROPHORESE
45
3.9
2
NORTHERN-TRANSFER
46
3.10
HYBRIDISIERUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
CDNA-SONDEN
MIT
DEN
NORTHEM-BLOTS
48
3.10.1
VERWENDETE
CDNA-SONDEN
48
3
10
2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
CDNA-SONDEN
50
3
10.3
HYBRIDISIERUNG
51
3
10.4
ENTWICKLUNG
DER
ROENTGENFILME
52
3
10.5
AUSWERTUNG
DER
AUTORADIOGRAMME
52
3.11
BESTIMMUNG
DER
7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLASE
(EROD)
52
3.11.1
ERNTE
DER
ZELLEN
FUER
DEN
EROD-TEST
52
3
112
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
53
3.11.3
FLUORIMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
EROD-AKTIVITAET
53
3.12
GEWINNUNG
VON
KEMEXTRAKTEN
54
3.12.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
55
3.13
WESTEM-BLOT-ANALYSE
55
3.13.1
VERWENDETE
ANTIKOERPER
55
3.13.2
DURCHFUEHRUNG
DER
WESTEM-BLOT-ANALYSE
56
4.
ERGEBNISSE
59
4.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PAI-2-EXPRESSION
IN
MENSCHLICHEN
ZELLEN
59
4.1.1
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
DER
MENSCHLICHEN
HEPATOMZELLINIE
HEPG2
59
4.1.1.1
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
INDUKTION
VON
PAI-2-MRNA
DURCH
TCDD
ODER
TPA
59
4.1
1.2
DOSISABHAENGIGKEIT
DER
INDUKTION
VON
PAI-2-MRNA
DURCH
TCDD
61
4.1.1.3
INDUKTION
DER
EROD-AKTIVITAET
DURCH
TCDD
62
4.1.2
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
MENSCHLICHEN
PRIMAERHEPATOZYTEN
64
4.1.3
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
MENSCHLICHEN,
PROMONOZYTISCHEN
U-937-ZELLEN
66
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
FREMDSTOFFMETABOLISIERENDER
ENZYME
UND
ZUR
EXPRESSION
DES
PAI-2
IN
PARENCHYMALEN
UND
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
67
4.2.1
GEWINNUNG
VON
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
67
4.2
2
INDUKTION
VON
CYP1
AL
DURCH
TCDD
UND
AROCLOR
1254
IN
DEN
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFIIGATION
GEWONNENEN
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
69
4.2.3
EXPRESSION
VON
HGF
UND
TGF-SSI-MRNA
IN
DEN
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFIIGATION
GEWONNENEN
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
71
4.2
4
EXPRESSION
VON
CYP1A1-,
UGT1.6
UND
PAI-2-MRNA
IN
DEN
DURCH
ELUTRIATION
GEWONNENEN
KUPFFER
UND
ENDOTHELZELLEN
72
4.2.5
UNTERSUCHUNGEN
AN
PRIMAERKULTUREN
DER
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
GEWONNENEN
KUPFFER
UND
ENDOTHELZELLEN
74
4.2.5.1
EROD-AKTIVITAET
IN
PRIMAERKULTUREN
VON
KUPFFER
UND
ENDOTHELZELLEN
74
4.25.2
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
PRIMAERKULTUREN
VON
KUPFFER
UND
ENDOTHELZELLEN
74
4.2.6
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
DER
LEBER
VON
TCDD-BEHANDEHEN
WEIBLICHEN
WISTAR-RATTEN
78
4.2.7
EXPRESSION
VON
CYP1A-,
UGT1.6
UND
PAI-2-MRNA
IN
PRIMAERHEPATOZYTEN
DER
RATTE
80
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MECHANISMUS
DER
PAI-2-INDUKTION
DURCH
TCDD
IN
MENSCHLICHEN,
PROMONOZYTISCHEN
U-937-ZELLEN
82
4.3.1
EINFLUSS
VON
TCDD
BZW.
TPA
AUF
DIE
MORPHOLOGIE
DER
U-937-ZELLEN
82
4.3.2
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
NACH
BEHANDLUNG
MIT
TPA
ODER
TCDD
84
4
3.3
DOSISABHAENGIGKEIT
DER
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
NACH
BEHANDLUNG
MIT
TPA
ODER
TCDD
86
4.3.4
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
NACH
SIMULTANER
BEHANDLUNG
MIT
TPA
UND
TCDD
87
4.3
5
INDUKTION
DES
PAI-2-PROTEINS
DURCH
TPA
UND
TCDD
88
4
3.6
EROD-AKTIVITAET
IN
U-937-ZELLEN
90
4.3.7
EXPRESSION
VON
AH-REZEPTOR-MRNA
IN
U-937-ZELLEN
90
4.3.8
EXPRESSION
VON
AH-REZEPTOR
UND
AMT-PROTEIN
NACH
BEHANDLUNG
MIT
TPA
ODER
TCDD
91
4.3.9
EXPRESSION
VON
MRNA
DER
PROTOONKOGENE
C-FOS,
C-JUN,
JUNB
UND
JUND
IN
U-937-ZELLEN
NACH
BEHANDLUNG
MIT
TPA
ODER
TCDD
92
4.3.10
EINFLUSS
DES
LOESUNGSMITTELS
UND
MECHANISCHER
BEANSPRUCHUNG
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
C-FOS-MRNA
IN
U-937-ZELLEN
94
5.
DISKUSSION
96
5.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INDUKTION
VON
PAI-2-MRNA
IN
MENSCHLICHEN
ZELLEN
96
5.1.1
DIE
PAI-2-INDUKTION
IN
DER
MENSCHLICHEN
HEPATOMZELLINIE
HEPG2
96
5
1.2
DIE
PAI-2-INDUKTION
IN
MENSCHLICHEN
PRIMAERHEPATOZYTEN
97
5.1.3
DIE
PAI-2-INDUKTION
IN
MENSCHLICHEN,
PROMONOZYTISCHEN
U-937-ZEILEN
(IM
VERGLEICH
ZU
HEPG2-ZELLEN)
97
5.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INDUKTION
VON
PAI-2-MRNA
IN
PARENCHYMALEN
UND
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
98
5.2.1
DIE
EXPRESSION
VON
WACHSTUMSFAKTOREN
IN
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
UND
DEREN
BEDEUTUNG
FUER
DIE
TUMORPROMOTION
98
5.2.2
DIE
INDUKTION
FREMDSTOFIMETABOLISIERENDER
ENZYME
IN
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
99
5.2.3
DIE
INDUKTION
FREMDSTOFIMETABOLISIERENDER
ENZYME
IN
PARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
100
5.2.4
DIE
EXPRESSION
VON
AH-REZEPTOR-MRNA
IN
PARENCHYMALEN
UND
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
101
5.2.5
DIE
EXPRESSION
VON
PAI-2-MRNA
IN
PARENCHYMALEN
UND
NICHTPARENCHYMALEN
ZELLEN
DER
RATTENLEBER
102
5.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MECHANISMUS
DER
PAI-2-INDUKTION
DURCH
TCDD
IN
U-937-ZELLEN
104
5.3.1
DIE
CYP1
AL-EXPRESSION
IN
U-937-ZELLEN
105
5.3.2
DIE
EXPRESSION
VON
AH-REZEPTOR
UND
AMT-PROTEIN
IN
U-937-ZELLEN
105
5.3
3
DIE
ZEITABHAENGIGKEIT
DER
PAI-2-INDUKTION
DURCH
TCDD
UND
TPA
IN
U-937-ZELLEN
106
5.3.4
DIE
DOSISABHAENGIKEIT
DER
PAI-2-LNDUKTION
DURCH
TCDD
UND
TPAINU-937-ZELLEN
107
5.3.5
DIE
EXPRESSION
VON
MRNA
DER
PROTOONKOGENE
C-JUN,
C-FOS,
JUNB
UND
JUND
IN
U-937-ZELLEN
UNTER
DEN
BEDINGUNGEN
DER
PAI-2-INDUKTION
108
5.3.6
MOEGLICHE
MECHANISMEN
DER
PAI-2-INDUKTION
DURCH
TCDD
UND
TPA
IN
U-937-ZELLEN
109
6.
ZUSAMMENFASSUNG
112
7.
LITERATURVERZEICHNIS
114 |
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