Untersuchungen zur Funktion des HoxA-Proteins als Regulator des Wasserstoff-oxidierenden Enzymsystems in Alcaligenes eutrophus:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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| Beschreibung: | Berlin, Freie Univ., Diss., 1995 |
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1
INHALT
SEITE
I.
EINLEITUNG
6
II.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
12
1.
STAEMME
UND
PLASMIDE
12
2.
NAEHRMEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
12
3.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
15
4.
KONSERVIERUNG
15
5.
DNA-ISOLIERUNG
16
5.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
16
5.2.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
A.
EUTROPHUS
16
6.
DNA-GRUNDTECHNIKEN
16
6.1.
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
16
6.2.
KONZENTRATION
VON
DNA
17
6.3.
RESTRIKTIONSVERDAUS
17
6.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
17
6.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
18
6.6.
DEPHOSPHORYLIERUNG
18
6.7.
LIGIERUNG
18
6.8.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT
32P
19
7.
DNA-SEQUENZIERUNG
19
7.1.
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
20
7.2.
ANHYBRIDISIERUNG
DES
PRIMERS
20
7.3.
SEQUENZIERREAKTION
21
7.4.
ANALYTISCHE
SCHRITTE
21
2
8.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
22
9.
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
23
10.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
23
10.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
APTG-AGAROSE
23
10.2.
IMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
24
10.3.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
HEPARIN-SEPHAROSE
24
11.
RENATURIERUNG
VON
PROTEINEN
25
12.
GEWINNUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
25
12.1.
IMMUNISIERUNGSSCHRITTE
25
12.2.
AUFREINIGUNG
DES
ANTISERUMS
26
12.2.1.
KOPPELN
VON
ANTIGEN
AN
SAEULENMATERIAL
26
12.2.2.
FAELLEN
DES
ROHSERUMS
26
13.
ENZYMMESSUNGEN
27
13.1.
LOESLICHE
HYDROGENASE
2
7
13.2.
MEMBRANGEBUNDENE
HYDROGENASE
27
13.3.
SS-GALACTOSIDASE
28
14.
PROTEINBESTIMMUNGEN
29
14.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
29
14.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
29
15.
ANALYTISCHE
TECHNIKEN
30
15.1.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
30
15.2.
PROTEINFAERBUNGEN
FUER
POLYACRYLAMIDGELE
32
15.2.1.
PROTEINFAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BLAU
32
15.2.2.
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
NACH
ANSORGE
33
15.3.
WESTERN
BLOT
34
15.3.1.
UEBERTRAGUNG
VON
PROTEINEN
AUF
NITROCELLULOSE
FOLIE
34
3
15.3.2.
ANTIKOERPER-FAERBUNG
35
15.4.
AUTORADIOGRAPHIE
VON
PA-GELEN
36
16.
PLASMIDUEBERTRAGUNG
IN
BAKTERIENZELLEN
36
16.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/Z-ZELLEN
36
16.1.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
36
16.1.2.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
37
16.2.
PLASMIDUEBERTRAGUNG
IN
A.
EUTROPHUS
37
17.
HETEROLOGE
GENEXPRESSION
IN
E.
COLI
38
18.
GELRETARDATIONSTESTS
38
19.
MATERIALIEN
39
III.
ERGEBNISSE
1.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
HOXA
ALS
FUSIONSPROTEIN
IN
E.
COLI
41
1.1.
EXPRESSIONSSYSTEM
FUER
DAS
SS-GAL-HOXA
FUSIONSPROTEIN
41
1.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
42
1.3.
COLLAGENASE-SPALTUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
43
2.
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
GEGEN
HOXA
45
3.
EXPRESSION
VON
HOXA
IN
A.
EUTROPHUS
M
3.1.
EXPRESSION
IN
VERSCHIEDENEN
STAEMMEN
47
3.2.
EXPRESSION
UNTER
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMS
BEDINGUNGEN
48
4.
REINIGUNG
VON
HOXA
AUS
A.
EUTROPHUS
DURCH
IMMUN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
50
5.
ANREICHERUNG
VON
FUNKTIONELLEM
HOXA
AUS
A.
EUTROPHUS
51
4
6.
SPEZIFISCHE
BINDUNG
VON
HOXA
AN
PROMOTORREGIONEN
DER
HYDROGENASE-STRUKTURGENE
55
7.
HOXA
AUS
DEM
TEMPERATURRESISTENTEN
STAMM
HF117
59
8.
SEQUENZIERUNG
VON
HOXA
AUS
HF117
60
9.
REKONSTITUTION
DES
TEMPERATURRESISTENTEN
PHAENOTYPS
DURCH
GEZIELTE
MUTAGENESE
DES
WILDTYPS
H16
61
9.1.
MUTAGENESE
61
9.2.
MESSUNGEN
ZUR
HYDROGENASE
UND
TRANSKRIPTIONS
AKTIVITAET
63
9.3.
DNA-BINDUNG
VON
HOXA
+
UND
HOXA
TT
67
10.
EXPRESSION
VON
HOXA
UND
HOXATR
UNTER
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
68
11.
DIE
ROLLE
VON
IHF
UND
G
54
70
IV.
DISKUSSION
7
4
V.
ZUSAMMENFASSUNG
96
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
98 |
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