Wechselwirkung der Enantiomere und Strukturanaloga der Liponsäure mit dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
MULTIENZYM-KOMPLEXE
1
1.2.
FUNKTION
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
2
1.3.
STRUKTUR
UND
REGULATION
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
3
1.3.1.
DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
BEI
E.COLL
3
1.3.2.
DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
DER
EUKARYONTEN
5
1.4.
DIE
LIPONSAEURE
9
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
12
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
14
2.1.
MATERIAL
14
2.2.
VERWENDETE
STAEMME
15
2.3.
MEDIEN
16
2.3.1.
MEDIEN
FUER
HEFESTAEMME
16
2.3.2.
MEDIEN
FUER
E.COU
16
2.3.3.
LOESEN
VON
LIPONSAEURE
UND
IHREN
STRUKTURANALOGA
IN
WASSER
17
2.4.
METHODEN
17
2.4.1.
DARSTELLUNG
VON
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
17
2.4.1.1.
SYNTHESE
VON
PIMELINSAEUREMONOETHYLESTER
CHLORID
AUS
PIMELINSAEUREDIETHYLESTER
17
2.4.1.2.
ADDITION
VON
ETHYLEN
AN
ADIPINSAEUREMONOMETHYL
ESTERCHLORID
UND
DESSEN
ANALOGA
UNTER
AICI
3
-
KATALYSE
18
2.4.1.3.
SYNTHESE
VON
METHYL-6,8-DICHLOROCTANOAT
19
2.4.1.4.
SYNTHESE
VON
6,8-DICHLOROCTANOL
19
2.4.1.5.
SYNTHESE
VON
8-BROM-1,3-DICHLOROCTANOAT
19
2.4.1.6.
SYNTHESE
VON
7,9-DICHLORNONANNITRIL
20
2.4.1.7.
SYNTHESE
VON
ETHYLEN-7,9-DICHLORNONANIMIDAT
HYDROCHLORID
20
2.4.1.8.
SYNTHESE
VON
ETHYL-7,9-DICHLORNONANOAT
20
2.4.1.9.
SYNTHESE
VON
7,
9-DI-(BENZYLTHIO)-NONANSAEURE
21
2.4.1.10
SYNTHESE
VON
D/L-1,2-DITHIOLAN-3-CAPRONSAEURE
21
2.4.2.
REINIGUNG
VON
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
22
2.4.2.1.
REINIGUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
RINDERHERZ
22
2.4.2.2.
ANREICHERUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
RATTENHERZ
23
2.4.2.3.
ANREICHERUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
RATTENNIERE
UND
AUS
RINDERHERZ
23
2.4.2.4.
REINIGUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
E.COLI
K12YMEL
24
2.4.2.S.
ANREICHERUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
DER
E.CO)I
MUTANTE
JRG26
25
2.4.3.
ENZYMATISCHE
METHODEN
26
2.4.3.1.
BESTIMMUNG
DER
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
DURCH
NAD-REDUK
TION
(NAD-REDUTKIONSTEST)
26
2.4.3.2.
BESTIMMUNG
DER
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
MIT
HILFE
DES
DISMUTATIONSTESTS
26
2.4.3.3.
BESTIMMUNG
DER
GESAMTAKTIVITAET
DES
A-KETOGLU
TARAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
27
2.4.3.4.
BESTIMMUNG
DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-AKTIVLTAET
28
2.4.3.5.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAET
DER
DIHYDROLIPONAMID
DEHYDROGENASE
28
2.4.4.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
UND
REINHEITSPRUEFUNG
VON
PROTEINEN
29
2.4.4.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
29
2.4.4.2.
POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
29
2.4.5.
SYNTHESE
DERANTIGENE
LIPONSAEURE
UND
BISNOR
LIPONSAEURE-RINDERSERUMALBUMIN
30
2.4.5.1.
SYNTHESE
DES
LIPONSAEURE
UND
BISNORLIPONSAEURE
N-HYDROXYSUCCINIMIDESTERS
30
2.4.5.2.
SYNTHESE
DES
RINDERSERUMALBUMIN-LIPONSAEURE
KONJUGATES
30
2.45.3.
SYNTHESE
DES
RINDERSERUMALBUMIN-BISNORLIPON
SAEURE-KONJUGATES
31
2.4.6.
ANTIKOERPERGEWINNUNG
UND
-REINIGUNG
31
2.4.6.1.
INDUKTION
DER
ANTIKOERPER
IN
KANINCHEN
31
2.4.OE.2.
ANTIKOERPERREINIGUNG
32
2.4.7.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
33
2.4.7.1.
WESTERN-BLOT
33
2.4.7.2.
ELISA
34
2.4.7.3.
ANTIGEN-ANTIKOERPER
REAKTION
OBER
DIE
BINDUNG
VON
14
C-LIPONSAEURE
34
2.4.8.
MUTAGENESE
UND
AUFSCHLUSS
VON
HEFEZELLEN
35
2.4.8.1.
MUTAGENESE
MIT
ETHYLMETHANSULFONAT
35
2.48.2.
AUFSCHLUSS
VON
HEFEZELLEN
MITTELS
GLASPERLEN
35
3.
ERGEBNISSE
37
3.1.
DARSTELLUNG
VON
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSOEURE
37
3.1.1.
SYNTHESE
VON
PIMELINSAEUREMONOETHYLESTERCHLORID
38
3.1.2.
ADDITION
VON
ETYLEN
AN
ADIPINSAEUREMONOMETHYL
ESTERCHLORID
UND
DESSEN
ANALOGA
39
3.1.3.
DARSTELLUNG
VON
D/L-1,2-DITHIOLAN-3-CAPRONSAEURE
40
3.2.
REINIGUNG
DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXE
AUS
VERSCHIEDENEN
ORGANISMEN
45
3.2.1.
REINIGUNG
AUS
RINDERORGANEN
45
3.2.2.
REINIGUNG
AUS
RATTENORGANEN
46
3.2.3.
REINIGUNG
AUS
E.COLL
47
3.3.
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
DER
ENAN
TIOMERE
UND
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
FREIEN
UND
KOMPLEXGEBUNDENEN
DIHYDROLIPONAMID-DEHYDROGENASE
48
3.3.1.
SUBSTRATSPEZIFITAET
UND
MECHANISMUS
DER
KATALYSE
DER
DIHYDROLIPONAMID-DEHYDROGENASE
49
3.3.2.
EINFLUSS
VON
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
DIHYDROLIPONAMID-DEHYDROGENASE
55
3.3.3.
HEMMMECHANISMUS
DER
FREIEN
DIHYDROLIPONAMID
DEHYDROGENASE
MIT
DEN
STRUKTURANALOGA
DER
LIPON
SAEURE
59
3.3.4.
EINFLUSS
DER
ENANTIOMERE
UND
STRUKTRANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
GESAMTAKTIVITAET
UND
DIE
EL-TEIL
REAKTION
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
63
3.3.4.1.
EINFLUSS
VON
ENANTIOMEREN
UND
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
AUS
RINDERORGANEN
64
3.3.4.2.
EINFLUSS
DER
ENANTIOMERE
UND
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
AUS
RATTENORGANEN
68
3.3.4.3.
EINFLUSS
DER
ENANMTIOMERE
UND
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
AUS
E.COTI
70
3.3.4.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
DER
ENANTIOMERE
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
E1-KOMPONENTE
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
72
3.4.
EINBAU
VON
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
IN
DEN
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
DES
E.COLI
STAMMES
JRG26
74
3.4.1.
WACHSTUM
VON
E.COLI
JRG26
MIT
DEN
ENANTIO
MEREN
UND
DEN
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
75
3.4.1.1.
WACHSTUM
DES
STAMMES
JRG26
MIT
DEN
LIPONSAEURE-ENANTIOMEREN
75
3.4.1.2.
WACHSTUM
DES
STAMMES
JRG26
MIT
DEN
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
77
3.4.2.
ISOLATION
VON
ANTI-LIPONSAEURE-ANTIKOERPERN
UND
ANTI-BISNORLIPONSAEURE-ANTIKOERPERN
80
3.4.2.1.
KOPPLUNG
VON
LIPONSAEURE
UND
BISNORLIPONSAEURE
AN
RINDERSERUMALBUMIN
81
3.4.2.2.
ISOLIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
RINDERSERUM
ALBUMIN-LIPONSAEURE
UND
RINDERSERUMALBUMIN
BISNORLIPONSAEURE
83
3.4.3.
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
ANTI-LIPONSAEURE
ANTIKOERPER
84
3.4.3.1.
NACHWEIS
DER
ANTIKOERPER-ANTIGEN-REAKTION
DURCH
DAS
ELISA-VERFAHREN
84
3.4.3.2.
IMMUNTITRATION
VON
PDC
MIT
ANTI-LIPONSAEURE
ANTIKOERPERN
85
3.4.3.3.
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
ANTI-LIPONSAEURE-ANTI
KOERPER
MIT
14
C-MARKIERTER
LIPONSAEURE
87
3.4.4.
WESTERN-BIOT-ANALYSE
DER
ANTI-LIPONSAEURE
UND
ANTI-BISNORLIPONSAEURE-ANTIKOERPER
89
3.4.4.I.
ANTIKOERPERREAKTION
MIT
DEN
KOMPONENTEN
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
89
3.4.4.2.
KREUZREAKTION
DER
ANTI-LIPONSAEURE
UND
ANTI
BISNORLIPONSAEURE-ANTIKOERPER
MIT
LIPONSAEURE
HOMOLOGEN
90
3.4.5.
NACHWEIS
DES
EINBAUS
DER
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
IN
DEN
PDC
AUS
E.COU
JRG26
95
3.4.5.1.
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXE
NACH
WACHSTUM
MIT
DEN
VERSCHIEDENEN
LIPONSAEURE-HOMOLOGEN
95
3.4.5.2.
NACHWEIS
DES
EINBAUS
VON
BISNORLIPONSAEURE
IN
DEN
PDC
AUS
E.COU
JRG26
DURCH
IMMUNTITRATION
96
3.4.5.3.
NACHWEIS
DES
EINBAUS
DER
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
IN
DEN
PDC
VON
E.COU
JRG26
UEBER
WESTERN-BLOT
98
3.4.6.
VERSUCHE
ZUR
ISOLATION
DER
LIPOYLDOMAENE
BZW.
DER
LIPONSAEURE
UND
IHRER
ANALOGA
AUS
DEM
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
107
3.4.6.1.
VERSUCHE
ZUR
ISOLIERUNG
DER
LIPOYLDOMAENE
107
3.4.62.
ENZYMATISCHE
ABTRENNUNG
DER
LIPONSAEURE
AUS
DER
E2-KOMPONENTE
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
E.COU
110
3.5.
VERSUCHE
ZUR
ISOLATION
EINER
IN
DER
LIPONSAEURE
BIOSYNTHESE
BZW.
DER
LIPOYL-PROTEIN-LIGASE
DEFEKTEN
HEFEMUTANTE
115
3.5.1.
MUTAGENESE
VON
HEFEZELLEN
115
3.5.2.
PDC-AKTIVITAETEN
DER
ISOLIERTEN
MUTANTEN
119
3.5.3.
UNTERSUCHUNG
DER
MUTANTEN
AUF
EINE
LIPON
SAEURE-BIOSYNTHESE
MUTATION
122
4.
DISKUSSION
124
4.1.
SYNTHESE
VON
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
124
4.2.
ANREICHERUNG
DES
PYRUVAT-DEHYDROGENASE
KOMPLEXES
AUS
SAEUGERZELLEN
UND
AUS
E.COLL
UND
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
DES
ENZYMKOMPLEXES
AUS
E.COH
125
4.3.
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
DIHYDROLIPONAMID
DEHYDROGENASE
129
4.4.
REAKTIONSMECHANISMUS
DER
DIHYDROLIPONAMID
DEHYDROGENASE
130
4.5.
EINFLUSS
DER
STRUKTURANALOGA
UND
ENANTIOMERE
DER
LIPONSAEURE
AUF
DIE
GESAMTAKTIVITAET
DES
PYRUVAT
DEHYDROGENASE-KOMPLEXES
132
4.6.
ANTIKOERPER
GEGEN
LIPONSAEURE
UND
BISNORLIPONSAEURE
136
4.7.
WACHSTUMSUNTERSUCHUNGEN
UND
SPEZIFISCHE
AKTIVI
TAETEN
DES
E.CO/7-STAMMES
JRG26
MIT
DEN
ENANTIO
MEREN
UND
STRUKTURANALOGA
DER
LIPONSAEURE
137
4.8.
COMPUTER-MODELL-UNTERSUCHUNGEN
DES
AKTIVEN
ZEN
TRUMS
DER
DIHYDROLIPONAMID-DEHYDROGENASE
140
4.9.
ERZEUGUNG
UND
ISOLATION
EINER
HEFEMUTANTE
IN
DER
LIPONSAEURE-BIOSYNTHESE
144
5.
AUSBLICK
145
6.
ZUSAMMENFASSUNG
146
7.
LITERATUR
148 |
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