Erzeugung und Charakterisierung von Phosphorylierungsmutanten im grossen T-Antigen des Polyomavirus durch ortsspezifische Mutagenese:
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| Format: | Abschlussarbeit Mikrofilm Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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1
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
. V
L
EINLEITUNG . 1
1.1 EINFUEHRUNG. 1
1.2 DIE FAMILIE DER POLYOMAVIREN. 1
1.3 DAS POLYOMAVIRUS. 2
1.3.1 DIE STRUKTUR UND DIE GENOMORGANISATION VON POLYOMAVIRUS. 2
1.3.2 DER LYTISCHE INFEKTIONSZYKLUS VON POLYOMAVIRUS. 4
1.3.3 DIE TRANSFORMATION DURCH DAS POLYOMAVIRUS. 4
1.3.4 DIE GENETISCHE ANALYSE DER T-ANTIGENE . 5
1.3.5 DIE EIGENSCHAFTEN UND FUNKTIONEN DER T-ANTIGENE . 5
1.3.5.1 DAS GROSSE T-ANTIGEN (LT). 5
1.3.5.2 DAS MITTLERE T-ANTIGEN (MT) . 7
1.3.5.3 DAS KLEINE T-ANTIGEN (ST) . 7
1.3.6 KONZEPTE ZUR MULTIFUNKTIONALITAET VON LT. 8
1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT. 9
L
MATERIAL UND METHODEN. 11
1.1 PLASMIDE, PHAGEN, ZUGEHOERIGE BAKTERIENSTAEMME UND MEDIEN. 11
2.1.1 PLASMIDE UND M13-PHAGEN. 11
2.1.2 BAKTERIENSTAEMME. 12
2.1.3 MEDIEN UND NAEHRBOEDEN. 13
2.2 PRAEPARATION, REINIGUNG UND AUFBEWAHRUNG VON PLASMID-DNA. 13
2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN . 14
2.2.1.1 ANALYTISCHE PLASMIDISOLIERUNG ("QUICK SCREEN") . 14
2.2.1.2 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG . 15
2.2.2 REINIGUNG VON PLASMID-DNA. 15
2.2.2.1 ZENTRIFUGATION IM CAESIUMCHLORID-GRADIENTEN. 15
2.2.2.2 INKUBATION MIT RNASE A UND PROTEINASE K . 16
2.2.2.3 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTIONEN. 16
2.2.2.4 ETHANOL-FAELLUNG . 16
2.2.3 AUFBEWAHRUNG VON PLASMID-DNA. 17
2.3 KLONIERUNGSTECHNIKEN.
17
2.3.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 17
2.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5'-ENDEN . 18
2.3.3 LIGIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN . 18
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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11
2.4 TRENNUNG UND UNTERSUCHUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS
GELELEKTROPHORESE 19
2.4.1 AUFTRENNEN UND SICHTBARMACHEN VON DNA-FRAGMENTEN IN AGAROSE-
GELEN. 19
2.4.2 GROESSEN- UND MENGENBESTIMMUNG VON DNA-FRAGMENTEN IN AGAROSE-
GELEN. 19
2.4.3 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN . 20
2.4.3.1 ELEKTROELUTION MITTELS BIOTRAP . 20
2.4.3.2 ELEKTROELUTION MITTELS DEAE-MEMBRAN. 21
2.5 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA. 22
2.5.1 HERSTELLEN KOMPETENTER BAKTERIEN . 22
2.5.2 TRANSFEKTION . 22
2.6 "M13"-METHODEN. 23
2.6.1 "M13"-METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON MUTANTEN NACH ZOLLER UND
SMITH . 23
2.6.2 M13-METHODEN ZUR HERSTELLUNG DER POLYOMAVIRUS-MUTANTEN NACH
KRAMER. 24
2.6.2.1 TRANSFEKTION MIT M13MP9-DNA. 24
2
.
6.22 ISOLIERUNG VON RF-DNA (REPLIKATIVE FORM). 25
2.6.2.3 ISOLIERUNG VON EINZELSTRANG-DNA (SS-DNA). 26
2.7 OLIGONUKLEOTIDE UND DEREN HANDHABUNG. 27
2.7.1 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE . 27
2.7.2 REINIGUNG DURCH FAELLUNG MIT ETHANOL. 28
2.7.3 REINIGUNG DURCH POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 28
2.7.3.1 HERSTELLUNG EINES HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGELS . 28
2.7.32 AUFTRENNUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN IM POLYACRYLAMIDGEL. 28
2
.
13.3 ELUTION VON OLIGONUKLEOTIDEN AUS POLYACRYLAMIDGELEN . 29
2.7.4 PHOSPHORYLIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN AM 5'-ENDE. 29
2.7.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT Y[32P]-ATP . 30
2.7.5.1 5'-TERMINALE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT T4-POLYNUKLEO-
TIDKINASE . 30
2.7.52 ABTRENNUNG VON NICHT EINGEBAUTEM Y[32P]-ATP DURCH ADSORPTIONS
CHROMATOGRAPHIE MITTELS ELUTIP-D-SAEULEN . 30
2.8 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE . 31
2.8.1 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE NACH ZOLLER UND SMITH [1982] . 31
2.8.2 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE NACH KRAMER [1982, 1984A] . 32
2.9 ANALYSE AUF MUTANTEN UND DEREN ISOLIERUNG . 33
2.9.1 TRANSFERTECHNIKEN . 33
2.9.1.1 KOLONIETRANSFER AUF PAPIERFILTER . 33
2.9.12 PLAQUE-TRANSFER AUF NITROZELLULOSE-FILTER . 34
2.9.2 HYBRIDISIERUNG VON PAPIER- UND NITROZELLULOSEFILTERN. . 35
2.9.3 BERECHNUNG VON HYBRIDISIERUNGS- UND WASCHTEMPERATUR. 35
2.9.4 ISOLIERUNG VON MUTANTEN . 36
2.10 DNA-SEQUENZBESTIMMUNG MIT DER KETTENABBRUCHMETHODE. 37
2.10.1 SEQUENZIERREAKTIONEN. 37
2.102 ANALYSE DER SEQUENZIERREAKTIONEN AUF HARNSTOFF-POLYACRYLAMID
GELEN . 38
2.10.2.1 KONTINUIERLICHES 6 %IGES HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGEL . 38
2.102.2 6 %IGES HARNSTOFF-POLYACRYLAMID-GRADIENTENGEL. 39
2.102.3 NACHBEHANDLUNG EINES HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGELS . 40
111
2.11 REINIGUNG VON POLYOMA-DNA DURCH ADSORPTIONSCHROMATOGRAPHIE . 40
2.12 ZELLKULTUR. 41
2.12.1 VIREN, ZELL-LINIEN UND ZELLKULTURBEDINGUNGEN . 42
2.12.2 PASSAGIEREN, EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN. 42
2.12.3 MYKOPLASMENTEST. 43
2.12.4 VIRUSINFEKTION . 43
2.12.5 VERMEHRUNG VON POLYOMA-VIREN ZUR GEWINNUNG VON VIRUSSTAMM
LOESUNGEN . 44
2.13
IN JAEU-NACHWEIS VON LT MITTELS IMMUNFLUORESZENZ . 45
2.14 TRANSFEKTION MITTELS LIPOFEKTIN. 45
2.15 ISOLIERUNG VON POLYOMA-DNA AUS ZELLEXTRAKTEN. 48
2.16
NACHWEIS DER VIRUSREPLIKATION . 49
2.16.1 ALKALISCHER DNA-TRANSFER AUS AGAROSEGELEN ("SOUTHERNBLOT") .
49
2.16.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PLASMID-DNA . 50
2.16.2.1 "RANDOM-PRIMING" - MARKIERUNG . 50
2.16.2.2 REINIGUNG DER MARKIERTEN DNA DURCH "SPINDIALYSE". 51
2.16.3 HYBRIDISIERUNG VON DNA AUF NYLONMEMBRANEN. 51
2.17
BEZUGSQUELLE DER CHEMIKALIEN, ENZYME UND SONSTIGEN MATERIALIEN. 52
3 ERGEBNISSE . 53
3.1
ERZEUGUNG VON MUTANTEN IM GROSSEN T-ANTIGEN VON POLYOMA. 53
3.1.1 HERSTELLEN DER MUTANTEN NACH ZOLLER UND SMITH. 54
3.1.2 HERSTELLEN DER MUTANTEN NACH KRAMER. 58
3.1.2.1 KLONIERUNG EINER POLYOMA-SEQUENZ IN DEN VEKTOR M 13MP9. 60
3.1.2.2 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE NACH KRAMER. 61
3.1.2.3 ANALYSE AUF MUTANTEN UND NACHWEIS DER EINGEFUEHRTEN MUTA
TIONEN . 63
3.1.2.4 RUECKKLONIEREN DER MUTIERTEN POLYOMA-TEILSEQUENZ IN DAS PLASMID
PLTL. 66
3.1.3 HERSTELLEN VON VIRUS-DNA AUS DEN PLASMIDEN PLTL UND PLTL
MU, . 67
3
2 CHARAKTERISIERUNG DER POLYOMAVIRUS-MUTANTEN. 68
3.2.1 DIE LT-EXPRESSION UND DIE LT-LOKALISATION DER MUTANTEN. 68
3.2.2 DIE VIRALE DNA-REPLIKATION . 70
3.2.2.1 DIE VIRALE DNA-REPLIKATION BEI ABWESENHEIT VON ST UND MT . . .
70
3.2.2.2 DIE VIRALE DNA-REPLIKATION BEI ANWESENHEIT VON ST UND MT . . .
72
3.2.2.3 DIE DNA-REPLIKATION DER MUTANTEN . 76
4
DISKUSSION . 79
4.1 METHODISCHE ASPEKTE . 79
4.1.1 HERSTELLEN VON LT-MUTANTEN . 79
4.1.2 ZELLSYSTEM UND TRANSFEKTIONSMETHODE . 81
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN.
YYYYYYYY.YY ' VUE ' WIVCTJR,
4.2.1 EXPRESSION UND LOKALISATION VON LT IN
3
T
6
-MAUSEFIBROBLASTEN . . .
DIE VIRALE DNA-REPLIKATION . YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY
DIE ABHAENGIGKEIT DER DNA-REPLIKATION VON ST/MT UND VOM WACHS
TUM DER WIRTSZELLEN. YY YY YY YY
YY
YYYYYYYYYY YY* YY YY
DER EINFLUSS DER POTENTIELLEN PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN SER 179, SER IW
UND DER PHOSPHORYLIERUNGSSTELLE THRL87 VON LT AUF DIE DNA-REPLIKA-
TION BEI POLYOMA.
YYYYYYYYYYYY ' ' \' ' ' '
EIN VERGLEICH DER PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN VON POLYOMAL 1 UND VON
SV40LT UND IHREN EINFLUSS AUF DIE VIRALE REPLIKATION.
4.2.2
4.2.2.1
4.2.2.2
4.2.2.3
4.3 AUSBLICK
81
82
83
84
88
90
93
5 ZUSAMMENFASSUNG
95
6 LITERATUR
96
DANKSAGUNG
109 |
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| title | Erzeugung und Charakterisierung von Phosphorylierungsmutanten im grossen T-Antigen des Polyomavirus durch ortsspezifische Mutagenese |
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| title_full | Erzeugung und Charakterisierung von Phosphorylierungsmutanten im grossen T-Antigen des Polyomavirus durch ortsspezifische Mutagenese vorgelegt von Maja Haas |
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