Isolierung, biochemische, immunologische und ultrastrukturelle Charakterisierung der Aminopeptidase A (ATA), Dipeptidylpeptidase IV (DAP IV) und Aminopeptidase M (APM) aus menschlichem Harn:
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1994
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1
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
5
1.1.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
PLASMAMEMBRANEN
5
1.2.
NIERENPLASMAMEMBRANEN
5
1.3.
NIERENPLASMAMEMBRAN
GEBUNDENE
PROTEASEN
ALS
MODU
LATOREN
VON
WACHSTUM
UND
DIFFERENZIERUNG
6
1.3.1.
AMINOPEPTIDASE
A
6
1.3.2.
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
7
1.3.3.
AMINOPEPTIDASE
M
7
1.4.
ROLLE
TUBULAERER
MEMBRANPROTEINE
ALS
POTENTIELLE
AUTOANTIGENE
8
1.5.
HARNENZYME
8
1.5.1.
PATHOPHYSIOLOGISCHE
ASPEKTE
DER
ENZYMURIE
9
1.5.2.
KLINISCHE
ASPEKTE
DER
ENZYMURIE
9
1.6.
SPEZIFISCHE
AUFGABENSTELLUNG
10
2.
ABKUERZUNGEN
12
3.
MATERIAL
14
3.1.
GERAETE
UND
ZUBEHOER
14
3.2.
REAGENZIEN
15
4.
METHODEN
16
4.1.
VORBEHANDLUNG
DES
NATIVEN
HARNS
16
4.2.
KONZENTRIERUNG
UND
ENTSALZUNG
VON
PROTEINEN
16
4.2.1.
-
MIT
DIALYSE
UND
HAEMOFILTERN
16
4.2.2.
-
MIT
DEM
MINITAN-TANGENTIALFLUSS-SYSTEM
16
4.2.3.
-
KONZENTRIERUNG
DURCH
LYOPHILISATION
18
4.2.4.
-
IM
DIALYSESCHLAUCH
MIT
AQUAZIDE
ODER
PEG
18
4.2.5.
-
DURCH
DIE
VAKUUMDIALYSE
18
4.2.6.
-
KONZENTRIERUNG
DURCH
DIE
AMICON-KAMMER
19
4.2.7.
-
ENTSALZUNG
UND
UMPUFFERUNG
UEBER
SEPHADEX
G-25-SAEULEN
(PD-10-SAEULEN)
19
4.3.
AUFREINIGUNG
UND
KONZENTRIEREN
DES
NATIVEN
URINKONZENTRATS
DURCH
FAELLUNG
19
4.3.1.
-
ULTRAZENTRIFUGATION
19
4.3.2.
-
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
19
4.3.3.
-
BUTANOLEXTRAKTION
20
4.4.
AUFREINIGUNG
DURCH
KONVENTIONELLE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
20
4.4.1.
-
WGA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
20
2
4.4.2.
-
CON
A-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
21
4.4.3.
-
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
PEANUT
UND
HELIX
POMATIA
IECTIN
21
4.4.4.
-
GELFILTRATION
MIT
SEPHACRYL
S-200
UND
S-300
SUPERFINE
21
4.5.
FAST
PROTEIN
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(FPLC)
22
4.5.1.
-
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MIT
MONO
Q
5/5
22
4.5.2.
-
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MIT
Q
SEPHAROSE
HP
16/10
23
4.5.3.
-
CHROMATOFOKUSSIERUNG
MIT
MONO
P
HR
5/5
23
4.5.4.
-
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
23
4.5.5.
-
GELFILTRATION
MIT
SUPEROSE
12
HR
10/30
24
4.5.6.
-
FLIESS-INJEKTIONS-ANALYSE
(FIA)
MIT
SUPEROSE
12
HR
10/30
25
4.5.7.
-
GELFILTRATION MIT
SUPERDEX
200
HP
16/60
25
4.6.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
IN
LOESUNGEN
26
4.6.1.
-
MIT
DER
BIURET-REAKTION
26
4.6.2.
-
NACH
LOWRY
26
4.6.3.
-
MIT
DEM
BCA-ASSAY
27
4.6.4.
-
NACH
BRADFORD
29
4.6.5.
-
MIT
DEM
BEHRING-NEPHELOMETER
29
4.7.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
29
4.7.1.
-
ANGIOTENSINASE
A
(ATA)
29
4.7.2.
-
AMINOPEPTIDASE
M
(APM)
30
4.7.3.
-
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
(DAP
IV)
30
4.7.4.
-
GAMMA-GLUTAMYLTRANSFERASE
(GGT)
30
4.7.5.
-
SEMIQUANTITATIVE
BESTIMMUNG
IN
MIKROTITERPLATTEN
30
4.7.6.
-
MIT
DEM
GREINER
G-400
AUTO-ANALYZER
31
4.8.
GELELEKTROPHORESEN
31
4.8.1.
ANALYTISCHE
GELELEKTROPHORESE
IM
PHAST-SYSTEM
31
4.8.1.1.
-
PROTEINMARKER
32
4.8.1.2.
-
SDS-PAGE
32
4.8.1.3.
-
NATIVE
PAGE
32
4.8.1.4.
-
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
33
4.8.1.5.
-
TITRATIONSKURVE
33
4.8.2.
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
33
4.8.2.1.
-
"HOMOGENISIERUNG"
DES
GELS
MIT
DEM
POTTER
34
4.9.
FAERBEN
DER
GELE
34
4.9.1.
COOMASSIE
BRILLANT
BLUE-FAERBUNG
IN
DER
FAERBEWANNE
34
4.9.2.
COOMASSIE
BRILLANT
BLUE-FAERBUNG
IM
PHAST-SYSTEM
34
4.9.3.
URSPRUENGLICHE
SILBERFAERBUNG
IM
PHAST-SYSTEM
35
4.9.4.
NEUE
SILBERFAERBUNG
IM
PHAST-SYSTEM
NACH
HEUKES
HOVEN
35
4.9.5.
ENZYMSPEZIFISCHE
ANFAERBUNG
DER
GELE
36
4.9.5.1.
-
AUF
AMINOPEPTIDASE
A
36
4.9.5.2.
-
AUF
AMINOPEPTIDASE
M
36
4.9.5.3.
-
AUF
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
37
4.9.5.4.
-
AUF
GAMMA-GLUTAMYLTRANSFERASE
37
4.10.
IMMUNISIERUNGEN
ZUR
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTI
KOERPER
37
3
4.11.
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
38
4.11.1.
ISOLIERUNG
DER
IMMUNGLOBULINFRAKTION
38
4.12.
IMMUNPRAEZIPITATION
38
4.12.1.
IMMUNTITRATION
38
4.12.2.
IMMUENDOPPELDIF
FUSION
38
4.12.3.
RADIALE
IMMUNDIFFUSION
39
4.13.
WESTERNBLOT
(
IMMUNOBLOT
)
39
4.13.1.
DURCHFUEHRUNG
DES
BLOTS
40
4.13.2.
BLOCKEN
DER
MEMBRANEN
NACH
PROTEINTRANSFER
40
4.13.3.
SPEZIFISCHE
IMMUN-DETEKTION DURCH
ANTIKOERPER
41
4.14.
HISTOCHEMIE
UND
IMMUNHISTOLOGIE
41
4.14.1.
PRAEPARATION
VON
GEFRIERSCHNITTEN
41
4.14.2.
AUFBEREITUNG
VON
PARAFFINSCHNITTEN
42
4.14.3.
ENZYMFAERBUNG
VON
GEWEBSSCHNITTEN
42
4.14.4.
IMMUNHISTOLOGIE
MIT
PEROXIDASE-MARKIERTEN
ANTI
KOERPERN
42
4.14.5.
IMMUNHISTOLOGIE
MIT
FLUORESZENZFARBSTOFFEN
43
4.15.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
IN
DER
NEGATIVE
STAINING
TECHNIK
43
5.
ERGEBNISSE
44
5.1.
VORVERSUCHE
44
5.1.1.
KONZENTRIERUNG
DES
NATIVEN
HARNS
MIT
HF
80-HAEMOFILTERN
44
5.1.2.
KONVENTIONELLE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
44
5.1.3.
BUTANOLEXTRAKTION
49
5.1.4.
LYOPHILISATION
49
5.2.
ANGIOTENSINASE
A
(ATA)
50
5.2.1.
REINIGUNG
DER
ANGIOTENSINASE
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
50
5.2.2.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANGIOTENSINASE
A
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
62
5.2.2.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MIT
DER
NATIV-PAGE
62
5.2.2.2.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MIT
GELFILTRATION
64
5.2.2.3.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MIT
DER
SDS-PAGE
65
5.2.2.4.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
67
5.2.2.5.
TITRATIONSKURVE
69
5.2.2.6.
EINFLUSS
VON
IONEN
AUF
DIE
ATA-AKTIVITAET
70
5.2.2.7.
STUDIEN
ZUR
LECTIN-BINDUNGSKAPAZITAET
71
5.2.2.8.
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
(KM)
72
5.2.3.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
DER
GEREINIGTEN
ATA
73
5.2.4.
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ATA
74
5.3.
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
(DAP
IV)
82
5.3.1.
REINIGUNG
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
82
5.3.2.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
73
5.3.2.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNGEN
86
5.3.2.2.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
88
5.3.2.3.
EINFLUSS
VON
IONEN
AUF
DIE
DAP
IV-AKTIVITAET
89
5.3.2.4.
PH-OPTIMUM
DER
DAP
IV
89
4
5.3.2.5.
STUDIEN
ZUR
LECTIN-BINDUNGSKAPAZITAET
DER
DAP
IV
90
5.3.2.6.
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
(KM)
91
5.3.3.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
DER
GEREINIGTEN
DAP
IV
92
5.3.4.
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DAP
IV
93
5.4.
AMINOPEPTIDASE
M
(APN)
101
5.4.1.
REINIGUNG
DER
AMINOPEPTIDASE
M
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
101
5.4.2.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
AMINOPEPTIDASE
M
AUS
MENSCHLICHEM
HARN
107
5.4.2.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNGEN
107
5.4.2.2.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
110
5.4.2.3.
EINFLUSS
VON
IONEN
AUF
DIE
APM-AKTIVITAET
111
5.4.2.4.
STUDIEN
ZUR
LECTIN-BINDUNGSKAPAZITAET
DER
APM
111
5.4.2.5.
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
(KM)
112
5.4.3.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
DER
GEREINIGTEN
APM
113
5.4.4.
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
APM
114
6.
DISKUSSION
120
6.1.
METHODIK
120
6.2.
STRUKTUR
DER
ISOLIERTEN
ENZYME
121
6.2.1.
MOLEKULARGEWICHTE
UND
UNTEREINHEITEN
DER
ISOLIERTEN
ENZYME
121
6.2.1.1.
AMINOPEPTIDASE
A
122
6.2.1.2.
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
124
6.2.1.3.
AMINOPEPTIDASE
M
128
6.2.2.
MULTIENZYMKOMPLEXE
130
6.3.
URSPRUNG
DER
ISOLIERTEN
AMINOPEPTIDASE
A
-
GLOMERULUM
ODER
TUBULUS?
131
6.4.
AUSBLICK
137
7.
ZUSAMMENFASSUNG
138
8.
LITERATURVERZEICHNIS
140
9.
EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN
169
10.
LEBENSLAUF
170 |
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title_full | Isolierung, biochemische, immunologische und ultrastrukturelle Charakterisierung der Aminopeptidase A (ATA), Dipeptidylpeptidase IV (DAP IV) und Aminopeptidase M (APM) aus menschlichem Harn vorgelegt von Jörg Wiemer |
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