N-Myristoyltransferase aus Trypanosoma brucei brucei: Untersuchungen zur N-Myristoylierung der trypanosomalen GPI-spezifischen Phospholipase C
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| Format: | Mikrofilm Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG
1
2. PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG 6
3.
EXPERIMENTELLER TEIL 8
3.1 GERAETE UND MATERIALIEN
8
3.1.1 GERAETE
3.1.2 CHEMIKALIEN 8
3.2 PEPTIDSYNTHESE AM POLYMEREN TRAEGER 10
3.2.1 ALLGEMEINES 10
3.2.2 SYNTHESE DER AKTIVESTERKOMPONENTE (HBTU) 10
3.2.2.1 1,1,3,3-TETRAMETHYL-2-CHLOROURONIUMCHLORID 10
3.2.2 2 KALIUM-N-HYDROXYBENZOTRIAZOLAT 11
3.2.2 3 2-(1-HYDROXY-1,2,3-BENZOTRIAZOM YL)-1,1,3,3-TETRAMETHYLURONIUM-
HEXAFLUOROPHOSPHAT 11
3.2.3 BELADUNG DES HARZES, AKTIVIERUNG UND KUPPLUNG 11
3.2.4 KONTROLLE DER BELADUNGSDICHTE AM HARZ 12
3.2.5 KAISER-TEST 12
3.2.6 ISOLIERUNG, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PEPTIDE 13
3.2.6.1 AMINOSAEURENANALYSE 14
3.2.62 FAB-MASSENSPEKTROMETRIE 14
3.3 SYNTHESE VON PHJN-MYRISTOYLIERTEN PEPTIDEN 14
3.4 BIOCHEMISCHE UND ANALYTISCHE METHODEN 15
3.4.1 PRAEPARATION DER TRYPANOSOMEN 15
3.4.2 NMT-PRAEPARATION 16
3.4.2.1 PROTEINBESTIMMUNG 17
3.4.3 ERMITTLUNG VON NMT-AKTIVITAET 18
3.4.3.1 SYNTHESE VON PH]MYRISTOYL-BZW. [
3H]PALMITOYL-COA 18
3.4.32 NMT-ASSAY 19
3.4.4 IDENTIFIZIERUNG DER N-MYRISTOYLIERTEN REAKTIONSPRODUKTE 19
3.4.4.1 HPLC 20
3.4.4 2 HPTLC 20
3.4.5 ERMITTLUNG VON NMT-AKTIVITAET IN PROZYKLEN 20
3.4.5.1 KULTIVIERUNG VON TRYPANOSOMEN 20
3.4.5.2 TRANSFORMATION VON BLUTSTROMFORMEN ZU INSEKTENFORMEN 21
3.4.6 SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG VON TRYPANOSOMEN 23
3.4.6.1 DIFFERENTIELLE ZENTRIFUGATION 23
3.4.6 2 ERMITTLUNG VON ENDOPEPTIDASEAKTIVITAET 23
3.4.7 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON TRYPANOSOMEN MIT PH]MYRISTINSAEURE,
OSMOTISCHE LYSE UND FPLC-GELFILTRATION 24
3.4.8 BESTIMMUNG VON PHOSPHOLIPASE C-AKTIVITAET 25
3.5 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 25
3.5.1 PRODUKTION VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN 25
3.5.2 IMMUNPRAEZIPITATION 26
3.5.3 IMMUNTITRATION 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.5.4 KOVALENTE KOPPLUNG VON IGG-ANTIKOERPEM AN PROTEIN A-SEPHAROSE 27
3.5.5 IMMUNOAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 27
3.5.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND FLUOROGRAPHIE 27
3.5.7 WESTERN-BLOT 29
3.5.8 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 29
4. ERGEBNISSE 31
4.1 PEPTIDSYNTHESE AM POLYMEREN TRAEGER 31
4.1.1 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON GNAAAARR 34
4.1.2 SYNTHESE,
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON GPI-PLC-PEPTIDEN 37
4.1.3 SYNTHESE VON PHJMYRISTOYLIERTEN PEPTIDEN 40
4.2 ENZYMATISCHE UNTERSUCHUNGEN 42
4.2.1 NACHWEIS VON NMT-AKTIVITAET IN
TRYPANOSOMA BRUCEI BRUCEI 42
4.2.2 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR NMT AUS
TRYPANOSOMA BRUCEI BRUCEI 45
4.2.3 ACYL-DONOR SPEZIFITAET DER NMT 47
4.2.4 SUBZELLULAERE VERTEILUNG DER NMT 47
4.2.5 AKZEPTOREIGENSCHAFTEN DER N-TERMINALEN GPI-PLC-PEPTIDE 49
4.2.6 ERMITTLUNG VON ENDOGENER AMINOPEPTIDASEAKTIVITAET IN
TRYPANOSOMA BRUCEI BRUCEI 51
4.2.7 NMT-AKTIVITAET IN PROZYKLEN 51
4.3 IMMUNOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNGEN 53
4.3.1 PRODUKTION VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN DEN N-TERMINUS DER
GPI-PLC 54
4.3.2 IMMUNTITRATION ZUR CHARAKTERISIERUNG DES ANTISERUMS 55
4.3.3 IMMUNPRAEZIPITATION DER GPI-PLC AUS EINER LOESLICHEN
TRYPANOSOMENFRAKTION
UND WESTEMBLOT 55
4.3.4 FLUOROGRAPHIE EINES METABOLISCH MARKIERTEN ZELLYSATES 57
4.3.5 IMMUNOAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 58
5. DISKUSSION 50
6. ZUSAMMENFASSUNG 56
7. LITERATURVERZEICHNIS 68
8. ANHANG
72
SEKUNDAER-IONEN-FAB-SPEKTRUM VON GNAAAARR 72
SEKUNDAER-IONEN-FAB-SPEKTRUM VON GVKWSPQS 72
SEKUNDAER-IONEN-FAB-SPEKTRUM VON GGVKWSPQS 73
SEKUNDAER-IONEN-FAB-SPEKTRUM VON MFGGVKWSPQS 73
SEKUNDAER-IONEN-FAB-SPEKTRUM VON MYRISTOYL-GNAAAARR 74
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