Untersuchung der Delta-Opioidrezeptor-vermittelten Signaltransmission in NG108-15-Hybridzellen mit unterschiedlicher G-Proteinausstattung:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
1
EINLEITUNG
UND
LITERATUR
1
1.1
OPIOIDE
_
1
1.1.1
TERMINOLOGIE
_
1
1.1.2
ENDORPHINE
_
2
1.1.3
OPIOIDREZEPTOREN
2
1.2
MODELLSYSTEME
FUER
DIE
UNTERSUCHUNG
ZELLULAERER
OPIOIDWIRKUNGEN:
PERMANENTE
NEURONALE
ZELLINIEN
3
1.2.1
NEUROBLASTOM
X
GLIOM
HYBRIDZELLINIE
NGI08-15
(HAMPRECHT,
1977)3
1.2.2
HUMANE
NEUROBLASTOM-ZELLEN
SH-SY5Y
(BIEDLER
ET
AL.,
1973)5
1.3
ZELLULAERE
MECHANISMEN
CHRONISCHER
OPIATWIRKUNG
5
1.4
G-PROTEINE
7
1.4.
1
DIE
A-UNTEREINHEITEN
INHIBITORISCHER
G-PROTEINE
10
1.4.1.1
INHIBITORISCHE
G-PROTEINE
(GI,
GO,
GL
1,
GL
2,
GZ)
10
1.4.1.1.1
GIL
II
1
4.1
1.2
GI2
11
I
4.1
1.3
GI3
II
1.4.1
1
4
GO
12
1.4.2
SSY-UNTEREINHEITEN
12
1.5
PERTUSSIS-TOXIN
UND
CHOLERA-TOXIN
14
15
1.1
ZELLULAERER
WIRKMECHANISMUS
VON
PTX
UND
CTX
14
1.5.2
ADP-RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHER
G-PROTEINE
MIT
CTX
16
1
.5.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
UND
DARSTELLUNG
SPEZIFISCH
AKTIVIERTER
INHIBITORISCHER
G-PROTEINE
18
2
FRAGESTELLUNG
19
3
MATERIAL
UND
METHODEN
21
3.1
ZELLKULTUR
_
21
3.1.1
ZELLINIE
_
2
1
3.1.1
1
KULTURBEDINGUNGEN
_
21
3.1.1
2
ZELLKULTURMEDIUM
_
21
3
1
1.3
LOESUNGEN
ZUR
ARBEIT
MIT
ZELLKULTUREN
_
22
3.1.2
ROUTINEMETHODEN
ZUR
HANDHABUNG
UND
SUBKULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
_
22
3.1.2.1
ALLGEMEINE
ARBEITSBEDINGUNGEN
_
22
3.1.2.2
EINFRIEREN
UND
KRYOKONSERVIERUNG
VON
NG108-15
HYBRIDZELLEN
_
22
3.1.2
3
AUFTAUEN
TIEFGEFRORENER
ZELLEN
_
24
3.1.2.4
MEDIUMWECHSEL
_
24
3.1.2.5
PASSAGIEREN
DER
ZELLEN
_
24
3.1.2.6
ERNTEN
DER
ZELLEN
25
3.2
DIFFERENZIERUNG
VON
NG108-15
HYBRIDZELLEN
MIT
FORSKOLIN
25
3.3
PRAEPARATION
EINER
PLASMAMEMBRAN-FRAKTION
_
25
3.3.1
PUFFER
_
25
3.3
2
VORGEHEN
26
3.4
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
(1951)
_
26
3.4.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
_
27
3.4.2
VORGEHEN
28
3.5
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
_
28
3
5.1
PRINZIP
DER
METHODE
_
28
3.5.1.1
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
_
29
3.5.1.2
SAMMEL
UND
TRENNGELSYSTEM
(DISKONTINUIERLICHES
GELSYSTEM)
NACH
LAEMMLI
(1970)30
I
NHALTSVERZEICHNIS
II
3.5.1.2.1
SDS-ELEKTROPHORESE
MIT
HAMSTOFFZUSATZ
31
3
5.1.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
INHIBITORISCHER
G-PROTEIN-A-UNTEREINHEITEN
IN
DER
SDS-PAGE3
1
3.5.2
3.5.2.
SUBSTANZEN
FUER
DIE
SDS-GELELEKROPHORESE
_
32
3.5.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
_
32
3.5
4
HERSTELLUNG
EINES
HAMSTOFFGRADIENTEN-TRENNGELS
_
35
3.5.4.1
VORGEHEN
ZUM
GIESSEN
EINES
4
BIS
8
M
HAMSTOFFGRADIENTENGELS
_
35
3.5.4.2
VORGEHEN
ZUM
GIESSEN
EINES
7
BIS
8
M
HAMSTOFFGRADIENTENGELS
_
36
3.5.5
HERSTELLUNG
UND
GIESSEN
DES
SAMMELGELS
_
36
3.5.6
ALKYLIERUNG
DER
PROBEN
_
36
3.5.7
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKROPHORESE
37
3.6
DETEKTION
AUFGETRENNTER
PROTEINE
(WESTERN-BIOTTING,
IMMUNOBLOTTING)
_
38
3.6.1
PRINZIP
DER
METHODE
38
3
6.2
SPEZIELLE
SUBSTANZEN
FUER
DAS
IMMUNOBLOTTING
_
39
3.6
3
LOESUNGEN
UND
PUFFER
_
39
3.6.4
VORGEHEN
_
40
3.6.4.1
AUFBAU
DER
"TRANSFEF
'
-EINHEIT
UND
UEBERFUEHREN
DER
PROTEINE
40
3.6.4
2
BLOCKEN
UNSPEZIFISCHER
BINDUNGSSTELLEN
AUF
DER
MEMBRAN
_
41
3
6
4
3
INKUBATION
MIT
SPEZIFISCHEN
ANTISEREN
42
3.6.4.4
INKUBATION
MIT
DEM
ZWEITEN
ANTIKOERPER:
42
3.6.4.5
ANFAERBUNG
DER
SPEZIFISCHEN
BINDUNGSSTELLEN
43
3.7
ADENOSIN-DIPHOSPHAT-RIBOSYLIERUNG
(ADP-RIBOSYLIERUNG)
VON
MEMBRANPROTEINEN
_
43
3.7.1.1.1
SUBSTANZEN
44
3.7.1
1.2
LOESUNGEN
UND
PUFFER
44
3.7.2
REZEPTORVERMITTELTE
AD[
J2
P]-RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHER
GI/GO-PROTEIN
A-UNTEREINHEITEN
MITTELS
DER
CTX-KATALYSIERTER
ADP-RIBOSYLIERUNG
45
3.7
2.1
PRINZIP
DER
METHODE
45
3.7.2
2
VORGEHEN:
46
3.7
2.2.1
AKTIVIERUNG
VON
CTX
(ROERIG
ET
AL
,
1992,
MODIFIZIERT)
46
3
7.2.2.2
AKTIVIERUNG
DES
ADP-RIBOSYLIERUNGSFAKTORS
(GILL
UND
WOOLKALIS,
1991,
MODIFIZIERT)
_
46
3.7
2
2.3
ADP-RIBOSYLIERUNGSREAKTION
MIT
CTX
47
3.7.3
REZEPTORUNABHAENGIGE
AD[
"
P]-RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHER
GI/GO-PROTEINA-UNTEREINHEITEN
MITTELS
DER
PTX-KATALYSIERTER
ADP-RIBOSYLIERUNG
47
3.7.3.1
PRINZIP
DER
METHODE
47
3
7.3.1.1
ADP-RIBOSYLIERUNG
MIT
PTX:
47
3.7.4
AUFBEREITUNG
DES
PROBENMATERIALS
48
3.7.5
AUTORADIOGRAPHISCHE
DARSTELLUNG
DER
MARKIERTEN
GIA/GOA-PROTEINE
48
3.7
5.1
MATERIAL
UND
SUBSTANZEN
48
3.7.5.2
LOESUNGEN
48
3.7
5
3
ARBEITSGANG
49
3.8
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
GI/GOA-PROTEINEN
49
3.8.1
PRINZIP
DER
METHODE
49
3.8.1.1
BEDEUTUNG
DER
IMMUNPRAEZIPITATION
FUER
DIE
FRAGESTELLUNG
50
3
8
2
SUBSTANZEN
50
3.8.3
LOESUNGEN
UND
PUFFER
51
3.8
4
SILIKOMSIEREN
VON
EPPENDORFF-GEFAESSEN_
_
52
3.8.4
1
PRINZIP
_
52
3.8.4.2
VORGEHEN
_
52
3.8
5
DURCHFUEHRUNG
EINER
IMMUNPRAEZIPITATION
52
3.9
HEMMUNG
DER
ADENYLATZYKLASEAKTIVITAET
DURCH
OPIOIDE
54
3.9
1
PRINZIP
DER
METHODE
_
54
3.9
2
SUBSTANZEN
55
3
9.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
55
3.9.4
DURCHFUEHRUNG
DER
CAMP-BESTIMMUNG
57
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
3.10
RADIOLIGAND-BINDUNGSSTUDIEN:
S-REZEPTOR-SAETTIGUNGSSTUDIEN
UND
HETEROLOGE
VERDRAENGUNGSEXPERIMENTE
_
60
3.10.1
METHODIK
60
3.10.1.1
GRUNDLAGEN
DER
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
PHARMAKON
(LIGAND)
UND
BINDUNGSSTELLE
(REZEPTOR)
_
_
60
3.10
1.2
ANALYSE
NACH
SCATCHARD
(1949)62
3.10.1.3
PRINZIP
DER
5-REZEPTOR-SAETTIGUNGSSTUDIEN
63
3.10
1.4
PRINZIP
DER
HETEROLOGEN
VERDRAENGUNGSEXPERIMENTE
63
3.10.2
SUBSTANZEN
UND
REAGENTIEN
65
3
10.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
66
3.10
4
ARBEITSVORGANG
66
3.10.4.1
DURCHFUEHRUNG
DER
SAETTIGUNGSEXPERIMENTE
67
3.10.4.2
DURCHFUEHRUNG
EINES
VERDRAENGUNGSEXPERIMENTS
68
3.11
STATISTISCHE
BERECHNUNGEN
69
4
ERGEBNISSE
70
4.1
AUFTRENNUNG
INHIBITORISCHER
G-PROTEIN-A-UNTEREINHEITEN
IN
DER
SDS-POLYACRYLAMID
HARNSTOFT-GELELEKTROPHORESE
70
4.1
1
HAMSTOFFGELE
71
4.1.2
HAMSTOFFGRADIENTENGELE
71
4
1
2.1
4
BIS
8
M
HAMSTOFFGRADIENT
(CODINA
ET
AL.,
1991)71
4.1.2.2
HARNSTOFF
KONZENTRATIONSGRADIENT
IM
MINIGEL
72
4.1.2.2.1
4
BIS
8
M
HARNSTOFF
KONZENTRATIONSGRADIENT
72
4.1.2.2.2
7
BIS
8
M
HARNSTOFF
KONZENTRATIONSGRADIENT
_
73
4.1.3
VERWENDUNG
EINES
REDUZIERTEN
BISACRYLAMID-GEHALTES
(BACKLUND
ET
AL
,
1988)
_
74
4.1.4
VERKLEINERUNG
DES
PORENDURCHMESSERS
DES
GELS
DURCH
ERHOEHUNG
DES
PAA-GEHALTES
_
75
4.1.5
VERAENDERUNG
DER
WANDERUNGSGESCHWINDIGKEIT
DER
PROBEN
75
4.2
AUFTRENNUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
ADP-RIBOSYLIERTER
INHIBITORISCHER
G-PROTEIN-A
UNTEREINHEITEN
_
76
4
2.1
UEBERPRUEFUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
PTX-KATALYSIERTEN
ADP-RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHER
G-PROTEINE
76
4.2
2
UEBERPRUEFUNG
DER
SELEKTIVITAET
UND
EMPFINDLICHKEIT
VON
ANTI-GIA
ANTISEREN
FUER
ADP-RIBOSYLIERTE
GIA-PROTEINE
77
4.2
3
VERAENDERUNGEN
DER
ELEKTROPHORETISCHER
EIGENSCHAFTEN
ADP-RIBOSYLIERTER
INHIBITORISCHER
GIA/GOA
PROTEINE
77
4.3
IDENTIFIZIERUNG
REZEPTOR-AKTIVIERTER
GI/GO
A-UNTEREINHEITEN
MITTELS
CTX-KATALYSIERTER
AD|
"
P]-RIBOSYLIERUNG
79
4
3
1
REZEPTOR-VERMITTELTE
CTX-KATALYSIERTE
ADP-RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHENR
G-PROTEIN-A
UENTEREINHEITEN
IN
SH-SY5Y
MEMBRANEN
_
79
4
3.2
AD[
J2
P]
RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHER
G-PROTEINE
IN
MEMBRANEN
VON
NG
108-15
HYBRIDZELLEN
_
81
4.3.2.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
MIT
CTX
DARGESTELLTEN
BANDE
MIT
HILFE
DER
PTX-KATALYSIERTER
ADP
RIBOSYLIERUNG
INHIBITORISCHE
GI/GO-PROTEIN
-UNTEREINHEITEN
_
84
4.3
2.2
UEBERPRUEFUNG
DER
REZEPTOR-SELEKTIVITAET
DER
CTX-KATALYSIERTEN
AD[
32
P]-RIBOSYLIERUNG
VON
GIA2/GOAL
_
85
4.3.3
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
AD[
J2
P]-RIBOSYLIERTEN
GI
UND
GO
A-UNTEREINHEITEN
86
4.3.3.
1
VERWENDUNG
VERSCHIEDENER
PUFFER
_
86
4.3
3
2
VERWENDUNG
SILIKONISIERTER
GEFAESSE
FUER
DIE
IMMUNPRAEZIPITATION
_
88
43.3.3
VERAENDERUNG
DER
EXPOSITIONSDAUER
FUER
DIE
AUTORADIOGRAPHIE
_
88
4.3.4
MODFIZIERUNG
DER
EXPRESSION
INHIBITORISCHER
GI/GO-PROTEINE
ALS
FOLGE
EINER
FORSKOLIN-INDUZIERTEN
DIFFERENZIERUNG
VON
NGL
08-15
HYBRIDZELLEN
_
89
4.3.4.1
UEBERPRUEFUNG
DER
INFOLGE
EINER
FORSKOLIN-BEHANDLUNG
VERAENDERTEN
GIA/GOA
KONZENTRATIONEN
IM
WESTERN-BLOT
_
_
90
4
3.5
VERGLEICH
MIT
CTX
UND
VERSCHIEDENEN
OPIOIDEN
ADP^PJ-NBOSYLIERTER
GI-PROTEFNE
VON
NATIVEN
UND
DIFFERENZIERTEN
NG
ZELLEN
91
4.4
BEEINFLUSSUNG
DER
ADENYLATZYKLASEAKTIVITAET
DURCH
OPIOIDEFEHLER!
TEXTMARKE
NICHT
DEFINIERT
4.4
1
DOSIS-WIRKUNG
DARSTELLUNG
DES
INHIBITORISCHEN
EFFEKTES
VON
DPDPE
AUF
DIE
ADENYLATZYKLASEAKTIVITAET
_
95
4.4
2
HEMMUNG
DER
PGE]-STIMULIERTEN
ADENYLATZYKLASEAKTIVITAET
DURCH
VERSCHIEDENE
OPIOIDE
96
4.4
3
AUFHEBUNG
DER
OPIOIDREZEPTOR-VERMITTELTEN
HEMMUNG
DER
ADENYLATZYKLASEAKTIVITAET
DUCH
OPIOID
ANTAGONISTEN
98
4.5
RADIOLIGAND-SAETTIGUNG
_
100
4.5
1
BESTIMMUNG
DER
[
'
HJDPN-DISSOZIATIONSKONSTANTE
(KP )
UND
DER
MAXIMALEN
BINDUNGSKAPAZITAET
(MAX)
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
100
4.5
1.1
[
'
H]DPN-SAETTIGUNGSKURVE
100
4.5.1.2
ANALYSE
DER
SAETTIGUNGSKURVE
NACH
SCATCHARD
(1949)101
4.6
HETEROLOGE
VERDRAENGUNG
DES
RADIOLIGANDEN
[
'
H]DPN
MIT DADLE
ODER
DPDPE
_
104
4
6
1
HETEROLOGE
VERDRAENGUNG
DES
RADIOLIGANDEN
[
'
H]DPN
MIT
DPDPE
105
4
6.1.1
ANALYSE
ENTSPRECHEND
EINEM
ZWEI-BINDUNGSSTELLEN-MODELL
106
4.6.2
HETEROLOGE
VERDRAENGUNG
DES
RADIOLIGANDEN
DIPRENORPHIN
[
'
H]DPN
MIT
DADLE
107
4.6.2
I
ANALYSE
ENTSPRECHEND
EINEM
ZWEI-BINDUNGSSTELLEN-MODELL
108
5
DISKUSSION
112
6
ZUSAMMENFASSUNG
134
7
SUMMARY
136
8
LITERATURVERZEICHNIS
138 |
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