Faltung und Membraneinbau von Beta-Faß-Membranproteinen: OmpA und OmpF von Escherichia coli
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
STRUKTUR
VON
MEMBRANPROTEINEN
1
1.2.
FALTUNG
UND
INSERTION
2
1.3.
AEUSSERE
MEMBRANPROTEINE
VON
E.COLI
4
1.3.1.
OMPA
5
1.3.2.
OMPF
7
2.
PROBLEMSTELLUNG
UND
INHALT
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
8
3.
MATERIALIEN
9
3.1.
GERAETE
UND
PROGRAMME
9
3.2.
CHEMIKALIEN
UND
SAEULENMATERIALIEN
10
4.
METHODEN
11
4.1.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
OMPA
UND
OMPF
11
4.1.1.
FERMENTATION
11
4.1.2.
MEMBRANPRAEPARATION
UND
EXTRAKTIONEN
11
4.1.2.1.
MEMBRANPRAEPARATION
UND
VOREXTRAKTION
11
4.1.2.2.
OMPA-EXTRAKTION
12
4.1.2.3.
TRYPSINVERDAU
UND
OMPF-EXTRAKTION
12
4.1.3.
CHROMATOGRAPHIE
13
4.1.3.1.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
13
4.1.3.2.
GELFILTRATION
13
4.1.4.
SDS-GELELEKTROPHORESE
13
4.1.5.
PROTEINBESTIMMUNG
14
4.1.6.
LPS-NACHWEIS
NACH
TSAI
UND
FRASCH
14
4.2.
PRAEPARATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
VESIKEL
15
4.2.1.
PRAEPARATION
DER
VESIKEL
15
4.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
VESIKEL
15
4.3.
RUECKFALTUNG
UND
MEMBRANEINBAU
VON
OMPA
UND
OMPF
16
4.3.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINLOESLICHKEITEN
IN
WASSER
16
4.3.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
FALTUNGS
UND
EINBAUREAKTIONEN,
BESTIMMUNG
DER
AUSBEUTE
17
4.3.3.
CHARAKTERISIERUNG
DES
FALTUNGS
UND
INSERTIONSZUSTANDES
VON
OMPA
UND
OMPF
17
4.3.3.1.
CIRCULARDICHROISMUSSPEKTROSKOPIE
17
4.3.3.2.
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
18
4.3.3.3.
SDS-GELELEKTROPHORESE
UND
TRYPSINVERDAU
20
4.3.3.4.
LEITFAEHIGKEITSMESSUNGEN
AN
OMPF
22
4.3.4.
KURVENANPASSUNG
AN
DIE
KINETISCHEN
MESSDATEN
23
5.
REINIGUNG
VON
OMPA
UND
OMPF
26
5.1.
ERGEBNISSE
26
5.1.1.
FERMENTATION
UND
MEMBRANPRAEPARATION
26
5.1.2.
OMPA-REINIGUNG
27
5.1.3.
OMPF-REINIGUNG
27
5.1.4.
AUSBEUTE
UND
REINHEIT
27
5.2.
DISKUSSION
28
6.
RUECKFALTUNG
UND
MEMBRANINSERTION
29
6.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZUSTAENDE
VON
OMPA
UND
OMPF
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
UMGEBUNGEN
29
6.1.1.
ERGEBNISSE
29
6.1.1.1.
OMPA
29
6.1.1.2.
OMPF
32
6.1.2.
DISKUSSION
38
6.2
LOESLICHKEIT
IN
WASSER
UND
AUSBEUTE
DER
MEMBRANINSERTION:
OMPA
UND
OMPF
IM
VERGLEICH
40
6.2.1.
ERGEBNISSE
40
6.2.1.1.
LOESLICHKEITEN
IN
WASSER
40
6.2.1.2.
AUSBEUTE
DER
MEMBRANINSERTION
41
6.2.2.
DISKUSSION
48
6.3.
KINETISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
FALTUNG
VON
OMPA
49
6.3.1.
ERGEBNISSE
49
6.3.1.1.
UEBERSICHT:
FALTUNG
IN
VERSCHIEDENE
UMGEBUNGEN
49
6.3.1.2.
UNTERSUCHUNG
DES
MEMBRANEINBAUS
MIT
VERSCHIEDENEN
METHODEN
51
6.3.1.4.
ABHAENGIGKEIT
DER
KINETIK
DES
OMPA-MEMBRANEINBAUS
VOM
PH,
DER
LIPID
UND
DER
PROTEINKONZENTRATION
57
6.3.1.5.
QUANTITATIVE
ANALYSE
DES
MEMBRANEINBAUS
VON
OMPA
60
6.3.1.6.
ANLAGERUNG
VON
OMPA
AN
VESIKEL
UNTERHALB
DER
PHASENUMWANDLUNGSTEMPERATUR
69
6.3.2.
DISKUSSION
70
6.4.
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DER
FALTUNG
VON
OMPF
73
6.4.1.
ERGEBNISSE
74
6.4.1.1.
OMPF-TRIMERISIERUNG
IN
LIPID-VESIKEL
(OHNE
DETERGENZ)
74
6.4.1.2.
OMPF-TRIMERISIERUNG
IN
LIPID/DETERGENZ-MEMBRANEN
75
6.4.2.
DISKUSSION
76
7.
ZUSAMMENFASSUNG
79
8.
LITERATUR
81
9.
ANHANG
84 |
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