3-D-Struktur des membrangebundenen Annexin V mittels Elektronenmikroskopie: Präparation und Charakterisierung von Annexin VI ; Simulation der Annexin-V-Modulbewegung ; Modell der Dielektrizitätskonstante in Proteinen
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
S.
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
1.1
.
EXPERIMENTELLER
TEIL
1
1.2
.
THEORETISCHER
TEIL
2
2
.
EINLEITUNG
4
2.1
.
-
.
DIE
PROTEINFAMILIE
DER
ANNEXINE
4
2.2
.
MEMBRANBINDUNG
5
2.3
.
ATOMARE
STRUKTUR
5
2.4
.
AFFINITAET
UND
SPEZIFITAET
FUER
LIPIDE,
BINDUNGSMODELLE
7
2.5
.
DIE
LONENKANALAKTIVITAET
DER
ANNEXINE
9
2.6
.
ZUSTAND
DES
LIPIDS
BEI
GEBUNDENEM
ANNEXIN
10
2.7
.
STRUKTUREN
MEMBRANGEBUNDENER
ANNEXINE
10
2.8
.
MOTIVATION
UND
ZIELE
12
2.8.1.
3-D-STRUKTUR
DES
MEMBRANGEBUNDENEN
ANNEXIN
V
12
2.8.2
.
SIMULATION
BEOBACHTETER
MODULKONFORMATIONEN
12
2.8.3
.
ANNEXIN
VI,
DAS
EINZIGE
ACHT-DOMAENEN-ANNEXIN
13
2.8.4
.
DIELEKTRIZITAETSKONSTANTE
IM
PROTEIN
13
3
.
METHODEN
ZUR
PROTEINHERSTELLUNG
14
3.1
.
MOLEKULARBIOLOGIE
14
3.1.1
.
MATERIALIEN
FUER
DIE
MOLEKULARBIOLOGIE
14
3.1.1.1
.
BAKTERIEN
14
3.1.1.2
.
PLASMIDE
14
3.1.1.3
.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
PCR
15
3.1.1.4
.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG:
15
3.1.1.5
.
MEDIEN
16
3.1.1.6
.
PUFFER
16
3.1.1.7
.
BEZUGSQUELLEN
DER
MATERIALIEN
18
3.1.1.8
.
GERAETE
18
3.1.2
.
REINIGUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
19
3.1.3
.
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
19
3.1.4
.
TRANSFORMATION
VON
DNA
19
3.1.5
.
PLASMID-MIDI-PROTOKOLL
ZUR
DNA-ISOLIERUNG
19
3.1.6
.
STET-PROTOKOLL
ZUR
DNA-ISOLIERUNG
20
3.1.7
.
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
20
3.1.8
.
VERDAU
MIT
ENDORESTRIKTIONSNUKLEASEN
20
3.1.9
.
DNA-GELELEKTROPHORESE
20
3.1.10
.
EXTRAKTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GEL
21
3.1.11
.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
21
3.1.12
.
DNA-SEQUENZIERUNG
21
3.1.12.1.
DENATURIERUNG
22
3.1.12.2.
ANNEALING
22
3.1.12.3.
REAKTIONEN
22
3.1.12.4.
.
GIESSEN
EINES
DNA-GELS
22
3.1.12.5.
GELELEKTROPHORESE
23
3.1.13
.
DNA-AUSFAELLUNG
23
3.1.14
.
POLY
MERASEKETTENREAKTION
2
3
3.2
.
PROTEINEXPRESSION
UND
-REINIGUNG
24
3.2.1
.
PUFFER,
BEZUGSQUELLEN
24
3.2.2
.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
24
3.2.3
.
REINIGUNG
ANNEXIN
V
25
3.2.4
.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
ANNEXIN
VI
25
3.2.4.1
.
ZELLKULTUR
25
3.2.4.2
.
ZELLERNTE
26
3.2.4.3
.
ZELLAUFSCHLUSS
26
3.2.4.4
.
LIPOSOMENBINDUNG
VON
ANNEXIN
26
3.2.4.5
.
ANIONENAUS
TAUSCHERSAEULE
2
7
3.2.4.6
.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
27
3.3
.
CHARAKTERISIERUNGSMETHODEN
28
3.3.1
.
FLUORESZENZ
28
3.3.2
.
EILMANN'
S
TEST
ZUR
CYSTEINBESTIMMUNG
28
4
.
METHODEN
ZUR
STRUKTURAUFKLAERUNG
29
4.1
.
ROENTGENS
TRUKTURANAIYSE
29
4.1.1
.
ROENTGENSTREUUNG
AN
BIOLOGISCHEN
OBJEKTEN
29
4.1.2
.
KINEMATISCHE
THEORIE
30
4.1.2.1
.
STREUUNG
AN
AMORPHER
MATERIE
30
4.1.2.2
.
BEUGUNG
AM
GITTER
31
4.1.3
.
PATTERSONMETHODE
ZUR
PHASIERUNG
32
4.1.4
.
APPARATIVES
33
4.1.4.1
.
DATENAUFNAHME
3
3
4.1.4.2
.
AUSWERTUNGSPROGRAMME
34
4.2
.
METHODEN
FUER
DIE
3-D-KRISTALLISATION
34
4.2.1
.
DAMPFDIFFUSION,
SITZENDE
TROPFEN
35
4.2.1.1
.
FACTORIAL
SCREENING
35
4.2.1.2
.
FAELLUNGSMITTELVARIATIONEN
35
4.2.1.3
.
PH-VARIATIONEN
35
4.2.1.4
.
LI2SO4-VARIATIONEN
36
4.2.1.5
.
PH-PEG-VARIATIONEN
36
4.2.1.6
.EINWERTIGE
KATIONEN
37
4.2.1.7
.
ZWEIWERTIGE
KATIONEN
37
4.2.1.8
.
PUFFERSUBSTANZVARIATIONEN
37
4.2.2
.
HAENGENDE
TROPFEN
37
4.2.2.1
.
PH-VARIATION
IM
ALKALISCHEN
37
4.2.3
.
DIALYSEANSAETZE
38
4.3
.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
38
4.3.1
.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
AN
BIOLOGISCHEN
OBJEKTEN
38
4.3.2
.
THEORIE
DER
STEUUNG
UND
ABBILDUNG
39
4.3.2.1
.
STREUPROZESS,
AUFBAU
DES
MIKROSKOPS
39
4.3.2.2
.
ABBILDUNG
DURCH
DIE
OBJEKTIVLINSE
40
4.3.23
.
HELLFELDBILD
41
4.3.2.4
.
2-D-KRISTALL
42
4.4
.
2-D-KRISTALLISATION,
AUFNAHME
UND
BILDVERARBEITUNG
43
4.4.1
.
PHOSPHOLIPIDE
43
4.4.2
.
HERSTELLUNG
DER
TRAEGERFILME
44
4.4.3
.
KRISTALLISATIONSEXPERIMENTE
44
4.4.4
.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
DER
2-D-KRISTALLE
45
4.4.4.1
.
ALLGEMEINES
45
4.4.4.2
.
ORIENTIERUNG
45
4.4.4.3
.
AUFNAHMEPROZEDUR
IM
HELLFELD
46
4.4.4.4
.
ELEKTRONENBEUGUNG
47
4.4.5
.
EM
DER
3-D-KRISTALLE
VON
ANNEXIN
VI
47
4.4.6
.
BILDVERARBEITUNG
47
4.4.6.1
.
MITTELUNG
DER
2-D-KRISTALLE
47
4.4.6.2
.
EINZELPARTIKELMITTELUNG
48
4.4.6.3
.
REKONSTRUKTION
DES
LIPIDGEB.
ANNEXIN
V
49
4.4.6.4
.
P21-SYMMETRISIERUNG
DER
3-D-KRISTALLE
49
5
.
RESULTATE
DES
EXPERIMENTELLEN
TEILS
50
5.1
.
ANNEXIN
V
50
5.1.1
.
STRUKTUR
DES
MEMBRANGEBUNDENEN
ANNEXIN
V
50
5.1.1.1
.
KRISTALLBILDUNG
UND
-BEOBACHTUNG
50
5.1.1.2
.
ORIENTIERUNG
DES
ANNEXIN
AM
LIPID
52
5.1.1.3
.
EINGEBETTETE
TRIMERE
56
5.1.1.4
.
3-D-REKONSTRUKTION
58
5.1.1.5
.
KRISTALLE
UEBER
LOECHERN
63
5.1.1.6
.
EINLAGIGE
PROTEINSCHICHT
63
5.2
.
ANNEXIN
VI
65
5.2.1
.
KLONIERUNG
65
5.2.1.1
.
UMKLONIERUNG
VON
AVI-A2
IN
PRSET5D
65
5.2.1.2
.
HERSTELLUNG
UND
LIGATION
VON
AVI-C2
68
5.2.2
.EXPRESSION
UND
REINIGUNG
70
5.2.3
.
EIGENSCHAFTEN
UND
CHARAKTERISIERUNG
71
5.2.3.1
SEQUENZ,
HOMOLOGIEN
UND
ISOELEKTR.
PUNKT
71
5.2.3.2
.
INTRINSISCHE
FLUORESZENZ
73
5.2.3.3
-----------------------
CYSTEINBESTIMMUNG
75
5.2.4
.
PROJEKTIONSSTRUKTUR
AM
PHOSPHOLIPID
75
5.2.4.1
.
KRISTALLISATIONSEXPERIMENTE
75
5.2.4.2
.
DOMAENENSTRUKTUR
77
5.2.5
.
3-D-KRISTALLISATION
81
5.2.5.1
.
DAMPFDIFFUSIONSMETHODE
81
5.2.5.2
.
DIALYSEANSAETZE
82
5.2.5.3
.
KRISTALLDICHTEBESTIMMUNG
83
5.2.5.4
.
EM
DER
3-D-KRISTALLE
83
5.2.6
.
ROENTGENKRISTALLOGRAPHIE
AN
ANNEXIN
VI
86
5.2.6.1
.
AUFNAHME
DER
REFLEXE
86
5.2.6.2
.
DATENSTATISTIK
87
5.2.6.3
.
PATTERSONKORRELATIONEN
88
6
.
RESULTATE
DES
THEORETISCHEN
TEILS
93
6.1
.
EINFACHE
ELEKTROSTATISCHE
BERECHNUNGEN
93
6.1.1
.
PROTEINLADUNG
AUS
DER
PRIMAERSTRUKTUR
93
6.1.2
.
ENERGIEN
UND
DIPOLE
AUS
DER
WILDTYPSTRUKTUR
93
6.2
.
EINFACHE
SIMULATION
EINER
MOEGLICHEN
MODULBEWEGUNG
96
6.2.1
.
MOTIVATION
96
6.2.2
.
DIE
ELEKTROSTATIK
BEI
MODULROTATION
97
6.2.3
.
STREUUNG
DER
ENERGIE
99
6.2.4
.
BERUECKSICHTIGUNG
DER
VAN-DER-WAALS-ENERGIE
101
6.2.5
.
RELAXATION,
ALGORITHMUSBESCHREIBUNG
102
6.2.6
.
BEWEGTE
RESTE,
RMS-ABWEICHUNGEN
104
6.2.7
.
ENERGIEKURVEN
IM
VERGLEICH
105
6.2.8
.
FREIE
SCHWINGUNG
IN
LOESUNG
108
6.2.9
.
MEMBRANGEBUNDENER
FALL
108
6.2.10
.
ERGEBNISTABELLE
110
6.3
.
INHOMOGENE
DIELEKTRIZITAETSKONSTANTE
111
6.3.1
.
EINLEITUNG
111
6.3.2
.
BESTEHENDE
MODELLE
UND
MOTIVATION
112
6.3.3
.
DAS
MODELL
114
6.3.3.1
.
MIKROSKOPISCHE
SICHT
114
6.3.3.2
.
MAKROSKOPISCHE
SICHT
119
6.3.3.3
.
VERGLEICH
BEIDER
SICHTWEISEN
119
6.3.3.4
.
ERSTE
ABSCHAETZUNG
DER
DK'
S
123
7
.
DISKUSSION
127
7.1
.
3-D-STRUKTUR
DES
MEMBRANGEBUNDENEN
ANNEXIN
V
127
7.1.1.TRIMERISIERUNG
UND
KRISTALLBILDUNG
AM
PHOSPHOLIPID
127
7.1.2
.
UEBEREINSTIMMUNG
MIT
ANDEREN
EXPERIMENTEN
128
7.1.3
.
EINLAGIGE
PROTEINSCHICHT
128
7.1.4
.
MOLEKUELORIENTIERUNG
UND
DOMAENENSTRUKTUR
128
7.1.5
.
PERIPHERE
BINDUNG
129
7.1.6
.
ZUSTAND
DES
LIPIDS
130
7.2
.
ANNEXIN
VI
131
7.2.1
.EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
131
7.2.2
.
PROJEKTIONEN
DES
MEMBRANGEBUNDENEM
PROTEINS
132
7.2.3
.
3-D-KRISTALLISATION
133
7.3
.
DIPOLBERECHNUNGEN
UND
MODULBEWEGUNGSSIMULATION
134
7.3.1.
ALLGEMEINE
EIGENSCHAFTEN,
RECHNUNGEN
AM
WILDTYP
135
7.3.2
.
SIMULATIONEN
AN
MUTANTEN
138
7.3.3
.
KUENFTIGE
RECHNUNGEN
138
7.4
.
INHOMOGENE
DIELEKTRIZITAETSKONSTANTE
139
8
.
LITERATUR
142 |
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| spelling | Voges, Dieter Verfasser aut 3-D-Struktur des membrangebundenen Annexin V mittels Elektronenmikroskopie Präparation und Charakterisierung von Annexin VI ; Simulation der Annexin-V-Modulbewegung ; Modell der Dielektrizitätskonstante in Proteinen Dieter Voges Drei-D-Struktur des membrangebundenen Annexin V mittels Elektronenmikroskopie 1994 157 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Techn. Univ., Diss., 1995 Struktur (DE-588)4058125-1 gnd rswk-swf Chemische Struktur (DE-588)4009857-6 gnd rswk-swf Durchstrahlungselektronenmikroskopie (DE-588)4215608-7 gnd rswk-swf Annexine (DE-588)4253644-3 gnd rswk-swf Dielektrizitätszahl (DE-588)4149725-9 gnd rswk-swf Annexin V (DE-588)4253643-1 gnd rswk-swf Bildverarbeitung (DE-588)4006684-8 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Annexine (DE-588)4253644-3 s Struktur (DE-588)4058125-1 s Durchstrahlungselektronenmikroskopie (DE-588)4215608-7 s Bildverarbeitung (DE-588)4006684-8 s DE-604 Chemische Struktur (DE-588)4009857-6 s Annexin V (DE-588)4253643-1 s Dielektrizitätszahl (DE-588)4149725-9 s DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006754374&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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