Molekularbiologische Untersuchungen der proteasomalen Untereinheiten LMP7 und MC5:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Eppelheim, Wasserturmstr. 53
<<U.>> Gräf
1995
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INHALT
SEITE
I.
EINLEITUNG
1
1.1.
INTRAZELLULAERE
PROTEOLYSE
UND
IHRE
BEDEUTUNG
1
1.2.
STRUKTUR
DES
PROTEASOMS
2
1.3.
FUNKTION
DES
PROTEASOMS
6
1.3.1.
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
DES
PROTEASOMS
6
1.3.2.
DAS
26
S
PROTEASOM
9
1.3.3.
IN
VIVO
FUNKTION
DES
PROTEASOMS
10
1.3.4.
DIE
FUNKTION
DES
PROTEASOMS
INNERHALB
DES
IMMUNSYSTEMS
12
1.3.4.1.
AUFBAU
UND
FUNKTION
DES
IMMUNSYSTEMS
12
1.3.4.2.
DIE
ROLLE
DES
PROTEASOMS
INNERHALB
DER
ANTIGENPRAESENTATION
15
II.
FRAGESTELLUNG
19
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
20
3.1.
MATERIAL
20
3.1.1.
ZELLINIEN
20
3.1.2.
ANTIKOERPER
21
3.1.3.
VEKTOREN
21
3.1.4.
PHAGEN
UND
BAKTERIEN
21
3.1.5.
PHAGENBANKEN
22
3.1.6.
OLIGONUKLEOTIDE
22
3.1.7.
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
23
3.1.7.1.
MEDIEN
FUER
DIE
KULTUR
VON
ZELLINIEN
23
3.1.7.2.
KONDITIONIERTES
MEDIUM
23
3.1.7.3.
LB-MEDIUM
FUER
BAKTERIENKULTUR
24
3.1.8.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
24
3.1.9.
ZUSAETZE
27
3.2.
METHODEN
28
3.2.1.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
28
3.2.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
28
3.2.1.2.
BESTIMMUNG
DER
LEBENDZELLZAHL
28
3.2.1.3.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
29
3.2.1.4.
INDIREKTE
EINFARBENIMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
29
3.2.1.5.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
29
3.2.2.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
30
3.2.2.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
30
3.2.2.2.
ISOLATION
VON
DNA
30
3.2.2.2.
1.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
30
3.2.2.2.2.
PRAEPARATON
VON
1-PHAGEN
DNA
31
3.2.2.2.3.
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
31
3.2.2.3.
DNA
PRAEZIPITATION
32
3.2.2.4.
DNA
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
32
3.2.2.5.
CAESIUMCHLORIDGRADIENTEN
ULTRAZENTRIFUGATION
32
3.2.2.6.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
33
3.2.2.7.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
GENSONDEN
MIT
[
32
P]
33
3.2.2.8.
HYBRIDISIERUNG
MIT
GENSONDEN
34
3.2.2.9.
SEQUENZIEREN
VON
DNA
34
3.2.2.10.
SOUTHERN
BLOT
34
3.2.2.1
1.
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
VON
DNA
AUF
MEMBRANEN
35
3.2.2.12.
REPLIKA
VON
BAKTERIENKOLONIEN
35
3.2.2.13.
REPLIKA
VON
PHAGENPLAQUES
36
3.2.2.14.
LIGATIONEN
36
3.2.2.15.
DIE
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
36
3.2.2.16.
UMKLONIERUNG
VON
INSERTS
AUS
AE.-ZAP
IN
PBIUESCRIPT
37
3.2.2.17.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKERIEN
MITTELS
CACLJ
37
3.2.2.18.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKERIEN
FUER
DIE
ELEKTROTRANSFORMATION
38
3.2.2.19.
TRANSFORMATIONEN
38
3.2.2.19.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
BAKTERIEN
DURCH
ELEKTROTRANS
FORMATION
38
3.2.2.19.2.
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
E.
COLI
BAKTERIEN
38
3.2.2.20.
TRANSFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
39
3.2.2.20.1.
TRANSFEKTION
DURCH
ELEKTROPORATION
39
3.2.2.20.2.
TRANSFEKTION
DURCH
DIE
CAPO
4
-METHODE
39
3.2.2.21.
MIKROINJEKTION
40
3.2.2.22.
AUFFUELLEN
VON
UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
40
3.2.2.23.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
40
3.2.2.24.
ISOATION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
41
IV.
ERGEBNISSE
42
4.1.
MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG
VON
LMP7
42
4.1.1.
CDNA
NUKLEOTIDSEQUENZEN
DER
AF/IC-KODIERTEN
PROTEASOMALEN
UNTEREINHEIT
LMP7
VON
MAUS
BZW.
MENSCH
42
4.1.1.1.
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMP
7
CDNA
42
4.1.1.1.1.
SCREENING
DER
MAUS
CDNA-BIBLIOTHEK
42
4.1.1.1.2.
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
LMP-7
CDNA
44
4.1.1.1.3.
ANALYSE
DER
LMP-7
CDNA
UND
DER
DAVON
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
45
4.1.1.2
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
LMP7
CDNA
48
4.1.1.2.1.
SCREENING
DER
HUMANEN
CDNA
BIBLIOTHEK
48
4.1.1.2.2.
NUKLEOTIDSEQUENZ
DER
LMP7
CDNAUND
DEREN
CHARAKTERISIERUNG
49
4.1.2.
DIE
STRUKTUR
DES
HUMANEN
LMP7
GENS
52
4.1.2.1.
ISOLATION
UND
SEQUENZIERUNG
VON
LMP7
52
4.I.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
LMP7
GENS
54
4.1.3.
KNOCK-OUT
VON
LMP7
62
4.1.3.1.
HERSTELLUNG
DES
KNOCK-OUT
KONSTRUKTES
62
4.1.3.2.
SCREENINGVERFAHREN
ZUR
DETEKTION
VON
POSITIVEN
LMP7
KNOCK-OUT
KLONEN
63
4.1.3.2.1.
SCREENING
POSITIVER
LMP7
KNOCK-OUT
KLONE
DURCH
PCR
64
4.1.3.2.2.
SCREENING
POSITIVER
LMP7
KNOCK-OUT
KLONE
DURCH
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
66
4.167.3.3.
VERIFIZIERUNG
DES
HEMIZYGOTEN
ZUSTANDES
DER
MHC
REGION
VON
HMY2.A3M
67
4.1.3.4.
TRANSFEKTIONSSTRATEGIEN,
UM
IN
LMP7
EINEN
FUNKTIONELLEN
KNOCK-OUT
DURCHZUFUEHREN
71
4.1.3.4.1.
TRANSFEKTIONEN
DURCH
ELEKTROPORATION
71
4.1.3.4.2.
TRANSFEKTIONEN
DURCH
CALZIUMPHOPHATPRAEZIPITATION
72
4.1.3.4.3.
MIKROINJEKTIONEN
73
4.2.
MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG
VON
MC5
DURCH
FUNKTIONELLEN
KNOCK-OUT
75
4.2.1.
ISOLATION
UND
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
MC5
GENS
77
4.2.1.1.
SCREENING
EINER
GENOMISCHEN
BIBLIOTHEK
EINER
SJ129
MAUS
UND
ISOLATION
DERMC5DNA
77
4.2.1.2.
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
MC5
GENS
78
4.2.2.
HERSTELLUNG
EINES
KNOCK-OUT
KONSTRUKTES
FUER
MC5
82
V.
DISKUSSION
87
5.1.
ISOLATION
DER
CDNAS
FUER
LMP-7
(MAUS)
UND
LMP7
(MENSCH)
90
5.2
DIE
STRUKTUR
DES
HUMANEN
LMP7
GENS
93
5.3.
LMP7
KNOCK-OUT
IN
DER
HUMANEN
ZELLINIE
HMY2.A3M
96
5.4.
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
MC5
GENS
UND
HERSTELLUNG
EINES
MC5
KNOCK-OUT
KONSTRUKTES
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
100
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
102
VIII.
ABKUERZUNGEN
IX.
LEBENSLAUF |
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| author | Gräf, Uwe |
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