Erhöhung der Resistenz von Säugetierzellen gegenüber DNA-schädigenden Agenzien durch Transfektion von humaner cDNA:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
Kernforschungszentrum
1994
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Kernforschungszentrum <Karlsruhe>: KfK
5387 |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 1994. - Zsfassung in engl. Sprache |
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
ABKUERZUNGEN
EINLEITUNG
.
1
MATERIAL
&
METHODEN
.
13
MATERIAL
.
13
METHODEN
.
17
1.
ZELLKULTUR
.
17
1.1.
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
.
17
1.1.1.
TRANSFEKTION
DURCH
KALZIUMPHOSPHAT
-
KOPRAEZIPITATION
.
17
1.1.2.
TRANSFEKTION
MIT
POLYBREN
.
18
1.1.3.
ELEKTRO
PORATION
.
18
1.2.
ROENTGENBESTRAHLUNG
DER
ZELLINIEN
SC3T3/W
UND
BALB/C
.
19
1.2.1.
ROENTGENSELEKTION
VON
TRANSFIZIERTEN
SEID
-
ZELLEN
DURCH
FRAKTIONIERTE
BESTRAHLUNG
.
19
1.2.2.
ROENTGENSELEKTION
MIT
EINER
ROENTGENDOSIS
.
19
1.2.3.
DOSIS
-
EFFEKT
-
VERSUCHE
MIT
ROENTGENSTRAHLUNG
.
19
1.3.
ALKYLANTIENBEHANDLUNG
VON
CHO-9
-
ZELLKULTUREN
.
20
1.3.1.
SELEKTION
MIT
ALKYLANTIEN
.
20
1.3.2.
DOSIS
-
EFFEKT
-
VERSUCHE
MIT
ALKYLANTIEN
.
20
1.4.
ISOLIERUNG
VON
ZELLKLONEN
.
20
1.5.
FIXIEREN
UND
FAERBEN
VON
ZELLEN
.
21
2.
MESSUNG
VON
DNA
-
DSB
-
REPARATUR
.
21
3.
MESSUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
DER
O6-METHYLGUANIN-DNA-METHYLTRANSFERASE
.
22
4.
BAKTERIENKULTUR
.
22
4.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
CAC12
.
22
4.2.
ELEKTROPORATION
VON
E.
COLI
.
23
5.
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
23
5.1.
PRAEPARATION
VON
DNA
.
23
5.1.1.
PRAEPARATION
KLEINER
MENGEN
PLASMID
-
DNA
.
23
5.1.2.
PRAEPARATION
GROESSERER
MENGEN
PLASMID
-
DNA
.
24
5.1.3.
HIRTEXTRAKTION
VON
PLASMID
-
DNA
AUS
SAEUGERZELLEN
.
24
5.1.4.
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
SAEUGERZELLEN
.
24
5.1.5.
PRAEPARATION
VON
PLASMID
-
DNA
AUS
CDNA
-
GENBANKEN
.25
5.2.
PRAEPARATION
VON
RNA
.
25
5.2.1.
PRAEPARATION
VON
POLY
-
A+
-
RNA
.25
5.2.2.
PRAEPARATION
VON
GESAMT
-
RNA
.25
6.
SEQUENZIEREN
VON
DNA
.
26
7.
IN
VITRO
SYNTHESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
26
7.1.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
26
7.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
-
SONDEN
.27
8.
GELELEKTROPHORESE
.27
8.1.
AGAROSE
-
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
RNA
.27
8.2.
POLYACRYLAMID
-
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
SEQUENZIER
REAKTIONEN
.
28
9.
BLOT
UND
HYBRIDISIERTECHNIKEN
.
28
10.
ISOLIEREN
VON
E.
COLI
-
KLONEN
AUS
EINER
CDNA
-
GENBANK
.
29
11.
KLONIEREN
VON
DNA
.
30
12.
KONSTRUKTION
DER
BPV
-
CDNA
GENBANK
.
31
ERGEBNISSE
.
32
TEIL
1
.
32
ERHOEHUNG
DER
ZELLULAEREN
RESISTENZ
EINER
ZELLINIE
DES
CHINESISCHEN
HAMSTERS
DURCH
TRANSFER
VON
HUMANEN
DNA
-
REPARATURGENEN
.
32
1.
KLONIERUNG
DER
HUMANEN
N-METHYLPURIN-DNA-GLYKOSYLASE
UND
ANALYSE
TRANSGENER
CHO-9
-
ZELLINIEN
.
32
1.1.
ISOLIERUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
MPG
-
CDNA
AUS
DER
HUMANEN
PCD2
-
BANK
.
33
1.2.
TRANSFEKTION
DER
CDNA
DER
N-METHYLPURIN-DNA-GLYKOSYLASE
IN
CHO-9
-
ZELLEN
UND
ANALYSE
DER
ZELLULAEREN
RESISTENZ
TRANSGENER
ZELLINIEN
GEGENUEBER
BEHANDLUNG
MIT
ALKYLANTIEN
.
36
1.3.
TRANSFEKTION
EINER
MPG
-
ANTISENSE
-
CDNA
IN
DIE
CHO-9
-
ZELLINIE
.
40
2.
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HUMANEN
APURINEN
ENDONUKLEASE
UND
ANALYSE
TRANSGENER
CHO-9
-ZELLINIEN
.
42
2.1.
PCR
-
KLONIERUNG
DER
HUMANEN
APURINEN
ENDONUKLEASE
AUS
DER
PCD2
-
GENBANK
.
42
2.2.
EXPRESSION
DER
HUMANEN
APURINEN
ENDONUKLEASE
IN
CHO-9
-
ZELLEN
.
44
2.2.1.
TRANSFEKTION
DER
ZELLINIEN
CHO-9
UND
CHO-9MPG
MIT
DER
HUMANEN
APE-CDNA
.
44
2.2.2.
NORTHERN
BLOT
-
ANALYSE
VON
STABIL
MIT
DER
APE
-
CDNA
TRANSFIZIERTEN
CHO-9
-
ZELLINIEN
.
45
2.2.3.
ANALYSE
DER
STABIL
MIT
DER
APE
-
CDNA
TRANSFIZIERTEN
CHO-9
-
ZELLINIEN
IN
DOSIS
-
EFFEKT
-
VERSUCHEN
MIT
ALKYLIERENDEN
AGENZIEN.
46
2.2.4.
DIE
CHO-9MPG,APE
-
DOPPELTRANSFEKTANTEN
ZEIGEN
METHYL
TRANSFERASEAKTIVITAET
.
49
2.3.
ANALYSE
DER
INDUZIERBARKEIT
DER
HUMANEN
APURINEN
ENDONUKLEASE
.
50
TEIL
II
.
52
KOMPLEMENTATION
DER
ROENTGENSTRAHLEN
-
HYPERSENSITIVITAET
VON
SEID
-
ZELLEN
DURCH
TRANSFEKTION
MIT
MENSCHLICHER
CDNA
.
52
1.
ENTWICKLUNG
EINES
ROENTGENSELEKTIONSSYSTEMS
.
53
2.
ETABLIEREN
EINER
GEEIGNETEN
TRANSFEKTIONSMETHODE
.
55
3.
TRANSFEKTION
DER
SEID
-
ZELLINIE
SC3T3/W
MIT
DER
HUMANEN
PCD2-CDNA
-
BANK
.
55
3.1.
ROENTGENSELEKTION
DER
STABILEN
SEID
-
TRANSFEKTANTENKLONE
LIEFERT
STRAHLEN
RESISTENTE
ZELLINIEN
.
56
3.2.
ANALYSE
DER
ROENTGENSELEKTIONIERTEN
SEID
-
EINZELKLONE
IN
DOSIS
-
EFFEKT
-
VERSUCHEN
.
58
3.3.
ANALYSE
DER
GENOMISCHEN
DNA
DER
ROENTGENSTRAHLEN
-
RESISTENTEN
SEID
-
TRANSFEKTANTEN
.
59
3.4.
KLONIERUNG
HUMANER
CDNA
AUS
DEN
ROENTGENSTRAHLEN
-
RESISTENTEN
SEID
-
TRANSFEKTANTEN
.
59
3.5.
DIE
MONIERTEN
PCR
-
PRODUKTE
ZEIGEN
UMEINANDER
KEINE
KREUZ
HYBRIDISIERUNG
.
61
3.6.
DAS
0.7
KB
PCR
-
PRODUKT
HYBRIDISIERT
MIT
EINER
1.4
KB
MRNA
.
63
3.7.
DIE
SEQUENZ
DES
0.7
KB
PCR
-
PRODUKTES
IST
IN
DER
EMBL
-
DATENBANK
UNBEKANNT
.
64
3.8.
DAS
RETRANSFIZIERTE
0.7
KB
PCR
-
PRODUKT
FUEHRT
IN
EINIGEN
ROENTGEN
SELEKTIONS
-
VERSUCHEN
ZUR
ERHOEHTEN
STRAHLENRESISTENZ
DER
SEID
-
ZELLINIE
SC3T3/W
.
64
3.9.
DURCH
KOLONIE
-
HYBRIDISIERUNG
DER
PCD2
-
BANK
MIT
DEM
0.7
KB
PCR
-
PRODUKT
WERDEN
E.
COLI
-
KLONE
MIT
GROESSERER
CDNA
ISOLIERT
.
67
3.10.
RETRANSFEKTION
DER
PLASMIDE
AUS
DER
KOLONIE
-
HYBRIDISIERUNG
IN
DIE
ZELLINIE
SC3T3/W
.
68
4.
KONSTRUKTION
EINER
BPV-CDNA
-
BANK
.
69
4.1.
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDES
PSB
100
.
70
4.2.
KONSTRUKTION
DER
BPV-CDNA
-
BANK
.
72
5.
TRANSFEKTION
DER
SEID
-
ZELLINIE
MIT
DER
BPV-CDNA
-
BANK
.
72
5.1.
DIE
ROENTGENSELEKTION
DER
SEID
-
ZELLKLONE,
DIE
DURCH
TRANSFEKTION
MIT
DER
BPV-CDNA
-
BANK
ERHALTEN
WORDEN
WAREN,
LIEFERT
RESISTENTE
ZELLINIEN
.
72
5.2.
DOSIS
-
EFFEKT
-
VERSUCHE
MIT
ROENTGENSTRAHLUNG
.
73
5.3.
DIE
SECHS
UNABHAENGIG
VONEINANDER
ISOLIERTEN
ROENTGENRESISTENTEN
SEID
-
ZELLKLONE
ENTHALTEN
PLASMIDE
MIT
GLEICHEM
RESTRIKTIONSMUSTER
UND
GLEICH
GROSSEN
CDNA
-
INSERTIONEN
.
74
5.4.
KREUZHYBRIDISIERUNG
DER
PCR
-
PRODUKTE
AUS
DEN
RESISTENTEN
SEID
-
ZELLINIEN
DES
ERSTEN
UND
ZWEITEN
KLONIERUNGSANSATZES
.
75
5.5.
DIE
NEU
ISOLIERTEN
1.5
KB
PCR
-
PRODUKTE
UND
DAS
0.7
KB
PCR
-
PRODUKT
ZEIGEN
100%IGE
SEQUENZHOMOLOGIE
.
76
5.6.
RETRANSFEKTION
DER
DURCH
HIRTEXTRAKTION
ISOLIERTEN
PLASMIDE
IN
DIE
SEID
-
ZELLINIE
SC3T3/W
.
79
6.
DIE
ROENTGENSTRAHLEN
-
RESISTENTEN
SEID
-
ZELLINIEN
REPARIEREN
DURCH
IONISIERENDE
STRAHLEN
VERURSACHTE
DNA
-
DOPPELSTRANGBRUECHE
.
79
DISKUSSION
.
83
LITERATURVERZEICHNIS
.
96 |
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