Mechanismen der Transkriptionskontrolle des Proto-Onkogens c-jun:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
FZKA
1995
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Forschungszentrum <Karlsruhe>: Wissenschaftliche Berichte
5566B |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
Abkürzungen
Einleitung 1
Material 10
Bezugsquellen 1 0
Allgemein verwendete Lösungen 1 2
Radiochemikalien 1 2
Enzyme 1 3
Zellinien und Kulturbedingungen 1 3
Bakterien und Kulturbedingungen 1 3
Antikörper 1 4
Oligonukleotide 1 4
Plasmidkonstruktionen 1 6
Methoden 17
/. Allgemeine Arbeitsmethoden 1 7
Phenol/Chloroform Extraktion von Nukleinsäuren 1 7
Präzipitation von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen 17
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 1 7
Fragmentierung von DNA Molekülen durch Restriktions
endonukleasen 1 7
Auftrennung von DNA Fragmenten durch Gelelektrophorese 1 8
Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarose Gelen 1 8
Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden mit
T4 Polynukleotidkinase 1 9
Hybridisieren von komplementärer Einzelstrang Oligo
nukleotid DNA 20
Radioaktive Markierung von Oligonukleotid DNA mit
Klenow DNA Polymerase 20
Präparation von Zellextrakten 21
Proteingehaltbestimmung mit der Biorad Methode 22
//. DNA Klonierungstechniken 2 2
Ligation von DNA Fragmenten 2 2
Mutagenese mithilfe der Polymerasenkettenreaktion 2 2
Präparation kompetenter E.coli Bakterien 24
Transformation kompetenter Bakterien 24
Einfrieren von Bakterien 24
Präparation von rekombinanter Plasmid DNA 2 5
Minipreps 2 5
///. Zellkultur und Transfektionen 2 6
A. Zellkultur 2 6
Ablösen von Zellen 2 6
Einfrieren und Auftauen von Zellen 2 6
B. Transfektionen 2 6
IV. Analytische Methoden 2 7
Northern Blot 2 7
Nuclear Run On Analysen 29
RNase Protektionsanalyse 31
CAT Assay 3 2
Luciferase Assay 3 3
Immunfluoreszenz 3 3
In vivo Dimethylsulfat Footprint Analyse 34
In vitro Dimethylsulfat Footprint Analyse 3 5
Gelretardations Analyse 3 6
Methylierungs Interferenz Analyse 3 7
Ergebnisse 3 8
/. Transkriptionelle Regulation des durch Phorbolester
und UV Licht induzierbaren Gens c jun 3 8
Die Funktionen von Jun 1, Jun 2, CTF, NF Jun, Sp1 und FP
bei der frühen Induktion des c jun Promotors 3 9
//. In vitro Bindungsstellen des c jun Promotors 39
///. In vivo DNA Protein Interaktionen an Promotoren
von frühen und späten Genen 4 7
IV. In vitro DNA Protein Interaktionen an Jun 1, Jun 2 und FP 5 5
Die in vitro Proteinbindung an Oligonukleotide der AP 1
Sequenz von Kollagenase, t Pa, Jun 1 und Jun 2 56
Komplex 1 ist spezifisch für Jun 1 und Jun 2; Komplex 2
bindet sowohl an Jun 1, als auch an die AP 1 Sequenz von
Kollagenase und t Pa 5 7
Die Protein DNA Kontakte an Jun 1 und an der AP 1 Sequenz
des Kollagenase Promotors sind in vivo und in vitro identisch 5 9
Komplex 1 ist stabiler als Komplex 2 6 3
Komplex 2 besteht vor allem aus Jun und Fos Proteinen,
während Komplex 1 Jun und ATF 2 Proteine enthält 66
Der Faktor FP bindet spezifisch und unabhängig von Jun 2
während der Induktion und nachgeschalteter Repression
des c jun Promotors 69
V. Die in vivo Proteinbesetzung des c jun Promotors ändert
sich nicht nach Transformation von Zellen mit Adenovirus 74
VI. Die Besetzung von Jun 1 und Jun 2 unter zellulären
Bedingungen, in denen cJun Protein fehlt. 7 7
VII. Vor und nach der Differenzierung von F9 und
HL60 Zellen ändert sich die in vivo Proteinbesetzung
des c jun Promotors nicht. 78
Diskussion 84
/. Zwei AP 1 Bindungsstellen spielen die entscheidende Rolle
in der Regulation des c jun Promotors und werden von
cJun/ATF 2 Heterodimeren erkannt. 84
//. E1A wirkt reprimierend auf die Bindung von Jun/Jun oder
Jun/Fos Dimere, während es die Transaktivierungs¬
aktivität von Jun/ATF 2 Heterodimeren verstärkt 86
///. FP, NF Jun, Sp1, CTF und RSRF kooperieren mit Jun 1 und
Jun 2, können jedoch selbst keine Induzierbarkeit vermitteln 88
IV. Der c jun Promotor wird über einen putativen Multiprotein
komplex gesteuert, dessen Aktivität durch post
translationale Modifikationen verändert wird. 90
V. UV Licht und TPA aktivieren den c jun Promotor
über unterschiedliche Signalketten 93
VI. Die Regulation des c jun Promotors in undifferenzierten
F9 Zellen 95
VII. Die Regulation des c jun Promotors während
der Differenzierung 96
VIII. Die Repression des c jun Promotors 97
Literaturverzeichnis 1 01
Lebenslauf
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