Charakterisierung der Integrasen und Genome zweier ovin-capriner Lentiviren:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINFUEHRUNG
.
1
2.
ERGEBNISSE
.
15
2.1
VERMEHRUNG
OVIN-CAPRINER
LENTIVIREN
IN
GEWEBEKULTUR
.
15
2.1.1
ETABLIERUNG
UND
OPTIMIERUNG
PRIMAERER
SCHAF
UND
ZIEGENZELLKULTUREN
.
15
2.1.2
INFEKTION
PRIMAERER
SCHAF
UND
ZIEGENZELLKULTUREN
MIT
MVV
UND
CAEV
.
16
2.2
ISOLIERUNG
UND
AMPLIFIKATION
LENTIVIRALER
NUKLEINSAEUREN
.
16
2.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
RNA
UND
VIRALER
CDNA
.
16
2.2.2
AMPLIFIKATION
UND
SUBKLONIERUNG
DES
CDNA-GENOMS
VON
MVV
1514
.
18
2.3
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
INTEGRASEN
VON
CAEV,
MVV
UND
HIV
-1
.
20
2.3.1
AMPLIFIKATION
IN-KODIERENDER
DNAS
VON
CAEV
UND
MVV
.
20
2.3.2
SUBKLONIERUNG
DER
IN-KODIERENDEN
DNAS
.
21
2.3.3
VERGLEICH
DER
IN-SEQUENZEN
OVIN-CAPRINER
LENTIVIREN
.
21
2.3.4
PCR-MODIFIKATION
DER
IN-GENE
VON
CAEV, MVV
UND
HIV
1
.
27
2.3.5
SEQUENZANALYSE
DER
IN-GENE
.
28
2.3.6
EXPRESSION
DER
INTEGRASEN
.
;
.
31
2.3.7
REINIGUNG
DER
INTEGRASEN
.
33
2.3.8
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
A-IN-SEREN
.
38
2.4
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
CAEV
IN,
MVV
IN
UND
HIV-1
IN
.
47
2.4.1
TESTSYSTEME
FUER
DEN
NACHWEIS
VON
INTEGRASEAKTIVITAETEN
.
47
2.4.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFISCHEN
ENDONUKLEASEAKTIVITAETEN
.
47
2.4.3
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
ENDONUKLEASEAKTIVITAETEN
.
54
2.4.4
NACHWEIS
DER
INTEGRATIONSAKTIVITAETEN
.
54
2.4.5
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
INTEGRATIONSAKTIVITAETEN
.
55
2.4.6
NACHWEIS
DER
DISINTEGRATIONSAKTIVITAETEN
.
58
2.4.7
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
DISINTEGRATIONSAKTIVITAETEN
.
61
2.5
GENOMANALYSE
DES
CAPRINEN
LENTIVIRUSISOLATES
CAEV
75-G63
.
64
2.5.1
HERKUNFT
UND
PATHOLOGIE
.
64
2.5.2
PCR-AMPLIFIKATION
UND
KLONIERUNG
.
64
2.5.3
DIE
LONG
TERMINAL
REPEATS
(LTRS)
.
71
2.5.4
DAS
GAG-GEN
.
74
2.5.5
DAS
POZ-GEN
.
76
2.5.6
DAS
ENV-GEN
.
77
2.5.7
DAS
W/-GEN
.
79
2.5.8
DAS
TAL-GEN
.
80
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.9
DAS
REV-GEN
.
80
2.5.10
SONSTIGE
SEQUENZMERKMALE
.
82
2.6
GENOMANALYSE
DES
OVINEN
LENTIVIRUSISOLATES
MW
461
.
85
2.6.1
HERKUNFT
UND
PATHOLOGIE
.
85
2.6.2
PCR-AMPLIFIKATION
UND
KLONIERUNG
.
86
2.6.3
DIE
LANG
TERMINAL
REPEATS
(LTRS)
.
93
2.6.4
DAS
GAG-GEN
.
97
2.6.5
DAS
POL-GEN
.
98
2.6.6
DAS
ENV-GEN
.
99
2.6.7
DAS
VT/-GEN
.
101
2.6.8
DAS
TAT-GEN
.
102
2.6.9
DAS
REV-GEN
.
102
2.6.10
SONSTIGE
SEQUENZMERKMALE
.
103
2.7
DAS
OVINE
LENTIVIRUSISOLAT
MW
909
.
106
2.8
DIE
EVOLUTION
OVIN-CAPRINER
LENTIVIREN
.
107
3.
DISKUSSION
.
111
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
125
5.
LITERATUR
.
127
ANHANG
A:
MATERIAL
.
147
A.1
ZELLEN
UND
VIRUSISOLATE
.
147
A.1.1
ZELLEN
.
147
A.1.2
VIRUSISOLATE
.
147
A.2
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
.
147
A.2.1
BAKTERIEN
.
147
A.2.2
PLASMIDE
.
147
A3
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
149
A.3.1
PCR-PRIMER
.
149
A.3.2
LINKER
.
151
A.3.3
SEQUENZ-PRIMER
.
151
A.3.4
SUBSTRAT-OLIGONUKLEOTIDE
.
155
A4
ENZYME
UND
KITS
.
156
A.4.1
ENZYME
.
156
A.4.2
KITS
.
157
A3
SEREN
UND
ANTISEREN
.
157
A.5.1
SEREN
.
157
A.5.2
ANTISEREN
.
157
INHALTSVERZEICHNIA
A.6
FEIN
UND
RADIOCHEMIKALIEN
.
158
A.6.1
FEINCHEMIKALIEN
.
158
A.6.2
RADIOCHEMIKALIEN
.
159
A.7
MEDIEN
.
159
A.7.1
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
.
159
A.7.2
MEDIEN
FUER
DIE
EUKARYOTISCHE
ZELLKULTUR
.
160
AJI
VERBRAUCHSMATERIAL
UND
GERAETE
.
160
A.8.1
VERBRAUCHSMATERIAL
.
160
A.8.2
GERAETE
.
161
AD)
SOFT-UND
HARDWARE
.
162
ANHANG
B:
METHODEN
.
163
B.L
EUKARYOTISCHE
ZELLKULTUR
.
163
B.1.1
ETABLIERUNG
PRIMAERER
ZELLKULTUREN
.
163
B.1.2
KULTIVIERUNG
PRIMAERER
ZELLEN
.
164
B.1.3
KRYKONSERVIERUNG
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
.
164
B.2
VIRUSVERMEHRUNG
UND-AUFARBEITUNG
.
164
B.2.1
VIRUSVERMEHRUNG
.
164
B.2.2
PRAEPARATION
VIRALER
RNA
AUS
VIRIONEN
.
165
B.2.3
PRAEPARATION
VIRALER
CDNA
.
165
B.3
BAKTERIELLE
ZELLKULTUR
.
166
B.3.1
KULTIVIERUNG
VON
E.
COLI
.
166
B.3.2
KRYOKONSERVIERUNG
VON
E.
COLI
.
166
B.4
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
166
B.4.1
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
.
166
B.4.2
OLIGONUKLEOTIDREINIGUNG
.
167
B.5
AMPLIFIKATION
VIRUSSPEZIFISCHER
DNA-FRAGMENTE
.
168
B.5.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
168
B.5.2
PCR
.
168
B.6
ANALYSE
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
169
B.6.1
SPEKTROSKOPISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
169
B.6.2
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
.
169
B.6.3
ETHANOLFAELLUNG
.
.
169
B.6.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
169
B.6.5
DNA-REINGUNG
MIT
GLASMILCH
.
170
B.6.6
SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
170
B.6.7
SOUTHERN-TRANSFER
.
171
INHALTSVERZEICHNIS
B.6.8
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
.
171
B.7
MODIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
172
B.7.1
RESTRIKTIONSVERDAU
.
172
B.7.2
AUFFUELLEN
ZURUECKGESETZTER
3'-ENDEN
.
172
B.7.3
ABDAUEN
UEBERHAENGENDER
3'-ENDEN
.
172
B.7.4
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
173
B.7.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
173
B.7.6
LIGATION
.
173
B.7.
7
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
174
B.7.8
EXOIII/AFWNGBEAN-NUKLEASE-VERKUERZUNG
.
174
B.8
GEWINNUNG
VON
PLASMID-DNA
.
175
-
B.8.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COLI
-ZELLEN
.
-
.
175
B.8.2
TRANSFORMATION
.
175
B.8.3
MINI-PRAEPARATION
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
.
175
B.8.4
GROSS-PRAEPARATION
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
.
176
B.9
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
IN-FUSIONSPROTEINEN
.
177
B.9.1
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
177
B.9.2
EXPRESSION
VON
HEXAHISTIDINFUSIONSPROTEINEN
.
178
B.9.3
LYSE
DER
BAKTERIEN
FUER
DIE NICHT-DENATURIERENDE
AUFREINIGUNG
.
178
B.9.4
NICHT-DENATURIERENDE
AUFREINIGUNG
.
178
B.9.5
LYSE
DER
BAKTERIEN
FUER
DIE
DENATURIERENDE
AUFREINIGUNG
.
179
B.9.6
DENTURIERENDE
AUFREINIGUNG
.
179
B.10
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
180
B.10.1
ACETONLOESUNG
.
180
B.10.2
TCA-FAELLUNG
.
180
B.LL
PROTEINANALYSE
.
180
B.LL.L
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
180
B.11.2
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
181
B.12
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISVERFAHREN
.
181
B.12.1
KOPPLUNG
SYNTHETISCHER
PEPTIDE
.
181
B.
12.2
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINEN
.
182
B.
12.3
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
SEREN
.
182
B.12.4
IMMUNOBLOTTING
.
182
B.13
TESTS
AUF
IN-ENZYMAKTIVITAETEN
.
183
B.13.1
RADIOAKTIVE
ENDMARKIERUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
183
B.
13.2
HERSTELLUNG
VON
DNA-SUBSTRATEN
.
;
.
184
B.13.3
TEST
AUF
SPEZIFISCHE
INTEGRASEFUNKTION
.
184 |
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