Herstellung von Protease-resistentem, rekombinantem, humanem Parathyroidhormon und Parathyroidhormon-Fragmenten:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
A.
ABKUERZUNGEN
Y
1
EINLEITUNG
1
1.1
AKTIONSMECHANISMUS
DES
PARATHORMONS
1
1.2
SIGNALSTRANSDUKTION
DURCH
PARATHORMON
2
1.3
PARATHORMON
IM
BLUTKREISLAUF
UND
PHT-SPIEGEL
2
1.4
PARATHORMON-METABOLISIERUNG
5
1.5
STRUKTURDESPARATHORMONS
11
1.6
FUNKTIONELLE
DOMAENE
DES
PARATHORMON
13
1.7
AUFGABENTELLUNG
16
2
ERGEBNISSE
17
2.1
GEWINNUNG,
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
17
[PRO
1
]
-HPTH(
1-84)
2.2
HERSTELLUNG
VON
AUTHENTISCHEM
HPTH(L-84)
26
2.2.1
EXPRESSION
VON
HPTH(L-84)
MIT
DEM
PMALYYC-VEKTOR
26
2.2.2
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
AUTHENTISCHEM
HPTH(L-84)
28
2.2.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
HPTH(L-84)
32
2.3
PROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
VON
REKOMBINANTEM
[PRO
'
'
]-HPTH
UND
34
HPTH(L-84)
IN
VITRO
2.4
ENTWURF
PROTEASERESISTENTER
HUMANER
PARATHONNON-VARIANTEN
41
2.5
VERSUCH
DES
SCREENINGS
AUF
PROTEASERESISTENTE
FRAGMENTE
MIT
HILFE
DER
SPOT
SYNTHESE
43
2.6
VARIANTE
HPTH(28-48)-PEPTIDE
47
2.6.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
SYNTHETISIERTEN
PEPTIDE
49
2.6.2
SPALTUNG
MIT
PROTEASEN
53
2.6.3
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DER
VARIANTEN
PEPTIDE
56
2.7
DESIGN
VON
PROTEASE-RESISTENTEM
REKOMBINANTEM
HPTH(L-84)
60
2.7.1
HERSTELLUNG
DER
HPTH(L-84)-MUTEINE
60
2.7.2
REINIGUNG
DER
HPTH(L-84)-MUTEINE
62
2.7.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
PTH-MUTEINE
63
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.8
SPALTUNG
DER
HPTH(L-84)-MUTEINE
67
2.8.1
ABBAU
MIT
CATHEPSIN
D
67
2.8.2
HPTH-ABBAU
MIT
EINEM
LYSAT
AUS
NICBTPARENCHYMALEN
ZELLEN
AUS
MAUSLEBER
72
3
DISKUSSION
78
4
MATERIALIEN
UND
METHODEN
90
4.1
GERAETE
90
4.2
CHEMIKALIEN
91
4.2.1
OLIGONUCLEOTIDE
UND
PEPTIDE
91
4.2.2
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
91
4.3
PLASMIDE
92
4.4
BAKTERIEN
93
4.5
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
93
4.5.1
KULTURMEDIEN
93
4.5.2
TRANSFORMATION
IN
E.COLI
94
4.5.2.1
CACL
2
94
4.5.2.2
ELEKTROTRANSFORMATION
94
4.5.3
EXPRESSION
IN
E.COLI
95
4.5.3.1
EXPRESSION
IN
E.COLI
BL21
95
4.5.3.2
EXPRESSION
IN
E.COLI
N4830
95
4.6
ARBEITEN
MIT
DNA
96
4.6.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
96
4.6.2
DNA-FAELLUNG
UND
DNA-LAGERUNG
96
4.6.3
PHENOL-EXTRAKTION
96
4.6.4
DNA-ISOLIERUNG
97
4.6.4.1
PLASMID-ISOLIERUNG
IN
ANALYTISCHE
MASSSTAB
97
4.6.4.2
PLASMID-ISOLIERUNG
IN
SEMIPRAEPARATIVEN
MASSSTAB
98
4.6.4.3
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRANG-DNA
99
4.6.5
SPALTUNG
VON
DNA
99
4.6.6
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
100
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.6.7
KINASIERUNG
VON
DNA
100
4.6.8
LIGATION
VON
DNA
100
4.6.9
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
101
4.6.9.1
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
101
4.6.9.2
SEQUENZIERUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
102
4.6.9.3
LAUF
EINES
SEQUENZIERGELS
102
4.6.10
GERICHTETE
MUTAGENESE
103
4.6.10.1
MUTAGENESE
103
4.6.10.2
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
104
4.6.10.3
PCR-AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
104
4.7
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
105
4.7.1
PROTEINBESTIMMUNG
105
4.7.2
REINIGUNG
UND
GEWINNUNG
VON
REKOMBINANTEM
105
[PRO*]-HPTH(L-84)
4.7.2.1
GEWINNUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
105
4.7.2.2
SAURE
HYDROLYSE
ZUR
GEWINNUNG
DES
[PRO'
'
]-HPTH(L-84)
106
4.7.2.3
REINIGUNG
DES
[PRO
1
]-HPTH(
1-84)
106
4.7.2.3.1
LONAUSTASCH-BATCHCHROMATOGRAPHIE
106
4.7.2.3.2
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
107
4.7.2.4
REVERSE-PHASE-HPLC
107
4.7.3
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
AUTHENTISCHEM
HPTH(L-84)
107
4.7.3.1
Q-SEPHAROSE
108
4.7.3.2
ULTRAFILTRATION
108
4.7.3.3
FAKTOR-XA-SPALTUNG
108
4.7.3.4
MONO-Q
109
4.7.4
SDS-PAGE
109
4.7.5
COOMASSIEFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
110
4.5.6
NEPHGE
110
4.7.7
CD-SPEKTROMETRIE
111
4.7.8
MARKIERUNG
DER
AN
CELLULOSE-GEBUNDENEN
PEPTIDE
MIT
[L
L4
C]-ACETANHYDRID
112
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.8
ARBEITEN
MIT
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
112
4.8.1
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
112
4.8.2
KULTURBEDINGUNGEN
113
4.8.3
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELTEN
114
4.9
CAMP-BESTIMMUNG
NACH
STIMULATION
DER
ADENYLATCYCLASE
115
4.9.1
INDUKTION
116
4.9.2
BESTIMMUNG
116
4.10
BESTIMMUNG
DER
MITOGENEN
AKTIVITAET
117
4.11
PROTEASE-UNTERSUCHUNGEN
117
4.11.1
PROTEASEABBAU
AN
DEN
MARKIERTEN
PAPIERGEBUNDENEN
PEPTIDE
118
'4.11.2
SPALTUNG
VON
PEPTIDEN
UND
REKOMBINANTEM
HPTH(L-84)
IN-VITRO
118
4.11.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
SPALT-PRODUKTEN
4.11.4
PROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
VON
REKOMBINANTEN
HPTH(L-84)
MIT
119
EINEM
ZELLYSAT
AUS
NICHTPARENCHYMALEN
ZELTEN
DER
MAUSLEBER
119
4.11.4.1
ISOLIERUNG
VON
NICHTPARENCHYMALEN
ZELTEN
AUS
MAUSLEBER
119
4.11.4.2
HERSTELLUNG
VON
NICHTPARENCHYMALEM
ZELLYSAT
4.11.5
SPALTUNG
DES
HPTH(L-84)
UND
DER
HPTH(L-84)-MUTEINE
120
MIT
DEM
ZELLYSAT
120
5
ZUSAMMENFASSUNG
121
6
LITERATURVERZEICHNNIS
123 |
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