Untersuchungen zur Expression der lysosomalen beta-Galaktosidase in humanen Haut-Fibroblasten unter dem Einfluss von Zytokinen und in Fibroblasten von Patienten mit systemischer Sklerodermie:
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1995
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 1995 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
11 LYSOSOMALE SS-GALAKTOSIDASE
1.1.1. YYPROTECTIVE PROTEIN"
1.1.2. A-NEURAMINIDASE
1.1.3. TRANSPORT LYSOSOMALER ENZYME
1.1.4. ALTERNATIVES SPLEISSPRODUKT DER LYSOSOMALEN SS-GALAKTOSIDASE
1.1.5. PATHOLOGISCHE VERAENDERUNGEN DER AKTIVITAET DER LYSOSOMALEN
SS-GALAKTOSIDASE
1.2. LYSOSOMALE SS-GALAKTOSIDASE UND SYSTEMISCHE SKLERODERMIE
1 2,1 SYSTEMISCHE SKLERODERMIE
1.2.1.1. DER KOLLAGENMETABOLISMUS BEI DER SYSTEMISCHEN SKLERODERMIE
1.2.1.2. HISTOPATHOLOGISCHE BEFUNDE BEI SYSTEMISCHER SKLERODERMIE
1.2.1.3. SYSTEMISCHE SKLERODERMIE UND ZYTOKINE
1
.
2
.
1.4. THERAPIE DER SYSTEMISCHEN SKLERODERMIE
1 2.2. DIE ROLLE DER LYSOSOMALEN SS-GALAKTOSIDASE BEI SYSTEMISCHER
SKLERODERMIE
2. AUFGABENSTELLUNG
3. MATERIAL UND METHODEN
3 1 MATERIAL
3.1.1. CHEMIKALIEN
3.1.2. ZYTOKINE
3.1.3. ENZYME
3.1.4. VEKTOREN UND OLIGONUKEOTIDE
3.1.5. DNA- UND RNA-LAENGENSTANDARDS
3 16 RADIOAKTIV-MARKIERTE NUKLEOSIDTRIPHOSPHATE
3.1.7. FILME UND FOTOGRAFISCHES ZUBEHOER
3.18. BAKTERIENSTAEMME
3.1.9. MEDIEN, PUFFER, LOESUNGEN
3.2. METHODEN
3.2.1. ZELLKULTUREN
3.2.1.1. KULTIVIERUNG VON HUMANEN HAUT-FIBROBLASTEN
3 2.1.2. KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN
3 2 13. HERSTELLUNG KOMPETENTER /. CO//-ZCLLEN
3.2.1.4. TRANSFORMATION VON CY;//-ZELLEN
3.2.2 ALLGEMEINE NUKLEINSAEURE-TECHNIKEN
3.2.2.1. QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN
1
1
4
5
5
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31
32
32
32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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UJ UJ
32
3.2.2.2. PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION
3.2 2 3. FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 33
3.2 3 DNA-TECHNIKEN 33
3.2.3.1. PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG (MAXIPRAEPARATION) 33
3.2.3.2. ANALYTISCHE PLASMIDISOLIERUNG (MINIPRAEPARATION) 33
3.2.3.3. SEQUENZSPEZIFISCHE SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 34
3.2.3.4. MODIFIKATION VON RESTRIKTIONSTERMINI 34
3.2.3.5. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 34
3.2 3.6. DNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 35
3 2.3.7. ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN 35
3 2.3 8. RT-PCR 36
3.2.3.9. SEQUENZIEREN VON DNA-INSERTS 37
3.2.3.10. MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 37
3.2.3.11. SOUTHERN-BLOT UND -HYBRIDISIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN 38
3.2.4 RNA-TECHNIKEN 38
3.2.4.1. RNA-ISOLIERUNG 38
3.2.4.2. RNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 40
3 2.4 3. NORTHERN-BLOT UND -HYBRIDISIERUNG 40
3 2 4 4 RNA-DOT-BLOTS 41
3 2.4.5. SYNTHESE VON RADIOAKTIV- UND DIG-MARKIERTEN RNA-SONDEN 41
2.5 BESTIMMUNG DER RELATIVEN TRANSKRIPTIONSRATE (YYNUCLEAR RUN-ON") 43
3.2.5.1. IMMOBILISIERUNG VON CDNA-LNSERTS AUF NYLONMEMBRANEN
(CDNA-DOT-BLOTS) 43
3.2.5.2. PRAEPARATION VON ZELLKERNEN AUS FIBROBLASTEN 43
3 2 5.3.
IN
V//M-TRANSKRIPTION VON 11 ANSK 1 IPTIONSAKTIVEN KEINEN 4.3
.2.6. NACHWEIS MARKIERTER NUKLEINSAEUREN 44
2 7 ///.V/7//-HYBRIDISIERUNG 44
2.8 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITATEN 46
2.9. PROTEINBESTIMMUNG 47
3 2.10. STATISTISCHE AUSWERTUNG DER ERHALTENEN DATEN UND
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG DER AUTORADIOGRAPHIEN 47
4. ERGEBNISSE
4 I. KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON CDNA-KLONEN 48
4.1.1. CDNA-KLON DER LYSOSOMALEN SS-GALAKTOSIDASE 4S
4 1.2. CDNA-KLON DER GIYZERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE 52
4.1.3 SUBKLONIERUNG VON PGEMGAL 55
4.1.4. CDNA-KLON VON YYSS-GALACTOSIDASE-RELATED PROTEIN'VSS-GALAKTOSIDASE
57
4 15 UMKLONIEAING DES INSERTS VON PSPT19GAI.R 58
59
4.2. NORTHERN-ANALYSEN
4.2 1 BESTIMMUNG VON YYSTEADY-STATE'-MRNA-KONZENTRATIONEN IN
FIBROBLASTEN
VON AUSGEWAEHLTEN SKLERODERMIE-PATIENTEN 63
4.2.2. BEEINFLUSSUNG VON MRNA-"STEADY-STATE"-KONZENTRATIONEN IN
KULTIVIERTEN
HAUT-FIBROBLASTEN DURCH TGF-SS. IFN-Y UND TNF-A 67
4.2.2.1. EINFLUSS VON TGF-SS 67
4.2.2.2. EINFLUSS VON IFN-Y 70
4 2 2 3. EINFLUSS VON TNF-A 72
4.2.3 BEEINFLUSSUNG DER MRNA-'STEADY-STATE'-KONZENTRATIONEN VON
SKLERODERMIE-FIBROBLASTEN DURCH TGF-SS 73
4 3 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 75
4.3.1. BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET 75
4.3.11. BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASC-AKTIVITAET IN UEBERSTAENDEN UND
ZELLEXTRAKTEN VON KULTIVIERTEN HAUT-FIBROBLASTEN 75
4.3.2 EINFLUSS VON ZYTOKINEN AUF DIE AKTIVITAET DER LYSOSOMALEN
SS-GALAKTOSIDASE 77
4.3.2.1. EFFEKT VON TGF-SS 77
4.3 2 2. EINFLUSS VON IFN-Y 78
4 3 2 3 EINFLUSS VON TNF-A 80
4.3.3. EINFLUSS VON TGF-SS, TNF-A UND IFN-Y AUF ANDERE LYSOSOMALE ENZYME
81
4.3 4 BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE- UND A-NEURAMINIDASE-AKTIVITAET IN
UEBERSTAENDEN VON SKLERODERMIE-FIBROBLASTEN 87
4.4. UNTERSUCHUNGEN ZUR RELATIVEN TRANSKRIPTIONSRATE DER LYSOSOMALEN
SS-GALAKTOSIDASE-MRNA 89
UNTER DEM EINFLUSS VON TGF-SS
4.5. ///.V/M-HYBRIDISIERUNG
91
4 6 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER MRNA DES YYSS-GALACTOSIDASE RELATED
PROTEIN"
5. DISKUSSION
5.1. EXPRESSION DER LYSOSOMALEN SS-GALAKTOSIDASE IN KULTIVIERTEN
FIBROBLASTEN UND
HAUTSCHNITTEN VON SKLERODERMIE-PATIENTEN
5 2 AUSWIRKUNGEN VON ZYTOKINEN AUF DIE EXPRESSION DER SS-GALAKTOSIDASE
5 3 YYSTEADY-STATE"-MRNA-KONZENTRATION VON SKLERODERMIE-FIBROBLASTEN
UNTER DEM EINFLUSS VON TGF-SS
5 4 ALTERNATIVES SPLEISSPRODUKT DER LYSOSOMALEN SS-GALAKTOSIDASE
6. ZUSAMMENFASSUNG
7. LITERATURVERZEICHNIS
95
101
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