Pinosylvin-3-O-methyltransferase aus Kiefer (Pinus sylvestris L.): Reinigung, Charakterisierung und Induktion durch Ozon und Elicitor
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| adam_text | 5 PINOSYLVIN-3-O-METHYLTRANSFERASE AUS KIEFER (PINUS SYLVESTRIS L.):
REINIGUNG, CHARAKTERISIERUNG UND INDUKTION DURCH OZON UND ELICITOR.
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN VORGELEGT VON MONIKA TROST
AUS MUENCHEN APRIL 1994 INHALT I 1. EINLEITUNG 1 1.1 DER PHENOLISCHE
SEKUNDAERSTOFFWECHSEL IN PFLANZEN 1 1.2 BIOSYNTHESE DER PHENYLPROPANE 1
1.3 ABWEHRSTRATEGIEN VON PFLANZEN 2 1.4 VORKOMMEN, BIOSYNTHESE UND
FUNKTIONEN VON STILBENEN 7 1.4.1 BIOSYNTHESE DER STILBENE 8 1.4.2
FUNGITOXISCHE EIGENSCHAFTEN DER STILBENE 10 1.4.3 PHYTOTOXISCHE
WIRKUNGEN VON STILBENEN 11 1.5 METHYLTRANSFERASEN IM PHENOLISCHEN
SEKUNDAERSTOFFWECHSEL 11 1.5.1 EIGENSCHAFTEN DER METHYLTRANSFERASEN 12
1.6 OZON UND SEINE WIRKUNG AUF PFLANZEN 16 1.6.1 BILDUNG VON OZON 17
1.6.2 OZONWIRKUNG AUF PFLANZEN 17 1.7 THEMENSTELLUNG 20 2. MATERIAL UND
METHODEN 22 2.1 2.2 2.3 2.4 2.4.1 2.4.1.1 2.4.1.2 2.5 2.5.1 2.5.1.1
2.5.1.2 2.5.1.3 2.5.2 2.5.2.1 2.5.2.2 2.6 2.7 2.8 GERAETE CHEMIKALIEN
RADIOCHEMIKALIEN MATERIALIEN ZUR CHROMATOGRAPHIE SAEULENCHROMATOGRAPHIE
CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN FERTIGGELSAEULEN PFLANZENMATERIAL
KIEFERN-ZELLKULTUREN ANLEGEN UND KULTIVIERUNG VON SUSPENSIONSKULTUREN
ERSTELLEN EINER WACHSTUMSKURVE DER SUSPENSIONSKULTUREN ANZUCHT FUER DIE
ENZYMREINIGUNG KIEFERNKEIMLINGE ANZUCHT VON KIEFERNKEIMLINGEN IN
HYDROKULTUR CHARAKTERISIERUNG DES WACHSTUMSVERLAUFS DER KIEFERNKEIMLINGE
OZONBEHANDLUNG VON KIEFEMKEIMLINGEN BEHANDLUNG VON KIEFEMKEIMLINGEN MIT
PINOSYLVIN UND PINOSYLVIN- METHYLETHER BEHANDLUNG VON
SUSPENSIONSKULTUREN MIT PINOSYLVIN UND PINOSYLVIN METHYLETHER 22 23 23
24 24 24 24 25 25 26 26 26 27 27 28 28 30 31 N INHALT 2.9 BEHANDLUNG VON
SUSPENSIONSKULTUREN MIT ELICITOREN 31 2.9.1 PRAEPARATION UND HERKUNFT DER
PILZELICITOREN 31 2.9.2 BESTIMMUNG DES KOHLENHYDRATGEHALTS DER
ELICITOREN 32 2.9.3 ELICITORBEHANDLUNG DER ZELLEN 33 2.10 ANALYSE
PHENOLISCHER INHALTSSTOFFE 33 2.11 CHLOROPHYLLBESTIMMUNG 34 2.12
PROTEINBESTIMMUNG 35 2.13 RADIOAKTIVITAETSMESSUNG 35 2.13.1 MESSUNG IM
SZINTILLATIONSZAEHLER 35 2.13.2 MESSUNG MIT DEM LINEAR ANALYZER 35 2.13.3
MESSUNG IN HPLC-ELUATEN 35 2.14 MESSUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 36 2.14.1
PROTEINEXTRAKTION AUS PFLANZENMATERIAL 36 2.14.2
PHENYLALANIN-AMMONIAK-LYASE (PAL) 36 2.14.2.1 RADIOMETRISCHER TEST
(METHODE A) 36 2.14.2.2 TEST MIT HPLC-DETEKTION (METHODE B) 37 2.14.3
STILBENSYNTHASE 38 2.14.4 PINOSYLVINMETHYLTRANSFERASE 38 2.14.4.1
STANDARDTEST FUER ZELLKULTURMATERIAL 39 2.14.4.2 STANDARDTEST FUER
KEIMLINGSNADELN 40 2.14.5 CAFFEOYL-COA-3-O-METHYLTRANSFERASE 40 2.14.6
ZIMTALKOHOL-DEHYDROGENASE 41 2.15 REINIGUNG DER
PINOSYLVIN-3-O-METHYLTRANSFERASE 42 2.15.1 ZELLERNTE UND -AUFSCHLUSS
(REINIGUNGSSTUFE 1) 42 2.15.2 AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERUNG
(REINIGUNGSSTUFE 2) 43 2.15.3 HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
(REINIGUNGSSTUFE 3) 43 2.15.4 GELFILTRATION AN SEPHACRYL S 200 SUPERFINE
(REINIGUNGSSTUFE 4) 44 2.15.5 IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AN FRACTOGEL
EMD-TMAE (REINIGUNGSSTUFE 5) 44 2.15.6 FARBLIGANDENCHROMATOGRAPHIE AN
MATREX RED A (REINIGUNGSSTUFE 6) 44 2.15.7 CHROMATOFOKUSSIERUNG AN MONO
P (REINIGUNGSSTUFE 7) 45 2.16 CHROMATOGRAPHISCHES VERHALTEN DER
PINOSYLVIN-3-O-METHYLTRANS- FERASE AN WEITEREN
SAEULENCHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN 45 2.16.1 GELFILTRATION AN SUPEROSE 12
HR (FPLC) 45 2.16.2 FARBLIGANDEN-CHROMATOGRAPHIE 46 2.16.3 HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE AN PHENYLSEPHAROSE 46 2.16.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN SAH-SEPHAROSE 47 2.16.5
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN ATP-AGAROSE 48 IV INHALT 3.8
CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG DER PINOSYLVIN-3-O-METHYL- TRANSFERASE 96
3.8.1 TEST UND OPTIMIERUNG EINZELNER CHROMATOGRAPHISCHER SCHRITTE 96
3.8.1.1 HYDROPHOBE INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE (HIC) 96 3.8.1.2
IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AN TENTAKELMATERIALIEN 97 3.8.1.3
FARBLIGANDEN-CHROMATOGRAPHIE 98 3.8.1.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN
SAH-SEPHAROSEN 99 3.8.1.5 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN ATP-AGAROSEN 100
3.8.2 REINIGUNGSSEQUENZ FUER DIE PMT 100 3.8.2.1 ZELLEMTE UND -AUFSCHLUSS
ZUR ROHEXTRAKTGEWINNUNG (REINIGUNGSSTUFE 1) 100 3.8.2.2 FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG (REINIGUNGSSTUFE 2) 100 3.8.2.3 HYDROPHOBE
INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE AN BUTYLSEPHAROSE (REINIGUNGSSTUFE 3) 101
3.8.2.4 GELFILTRATION AN SEPHACRYL S200 SUPERFINE (REINIGUNGSSTUFE 4)
102 3.8.2.5 IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AN FRACTOGEL EMD-TMAE
(REINIGUNGSSTUFE 5) * 103 3.8.2.6 FARBLIGANDENCHROMATOGRAPHIE AN MATREX
RED A (REINIGUNGSSTUFE 6) 104 3.8.2.7 CHROMATOFOKUSSIERUNG AN MONO P
(FPLC) (REINIGUNGSSTUFE 7) 105 3.8.2.8 ZUSAMMENFASSUNG DER REINIGUNG
DURCH SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE SCHRITTE 106 3.9 CHARAKTERISIERUNG DER
PINOSYLVINMETHYLTRANSFERASE 109 3.9.1 PH-OPTIMUM 109 3.9.2
TEMPERATUR-OPTIMUM 109 3.9.3 STABILITAET DER ENZYMAKTIVITAET HO 3.9.4
ABHAENGIGKEIT VON MG^ + , ANDEREN ZWEIWERTIGEN IONEN UNDEDTA 111 3.9.5
SUBSTRATABHAENGIGKEIT DER PMT-AKTIVITAET UND BESTIMMUNG DER K M -WERTE FUER
PINOSYLVIN UND S-ADENOSYL-L-METHIONIN 112 3.9.6 SUBSTRATSPEZIFITAET DER
PMT-AKUEVITAET 114 3.9.7 HEMMUNG DER PMT DURCH SAH UND BESTIMMUNG DES
KI-WERTES 116 3.9.8 MOLEKULARGEWICHT DES NATIVEN ENZYMS 118 3.9.8.1
GELFILTRATION AN SEPHACRYL S 200 SUPERFINE 118 3.9.8.2 GELFILTRATIOEN AN
SUPEROSE 12 HR (FPLC) 120 3.9.9 BESTIMMUNG DES ISOELEKTRISCHEN PUNKTES
121 INHALT V 3.10 ELEKTROPHORETISCHE REINIGUNG ZUR HOMOGENITAET UND
IDENTIFIZIERUNG DES ENZYMPROTEINS 121 3.10.1 PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
DES PMT-PROTEINS 122 3.10.2 NATIVE GELELEKTROPHORESE 124 3.10.2.1
ENZYMPRAEPARATION DER REINIGUNGSSTUFE 7 124 3.10.2.2 ENZYMPRAEPARATION DER
REINIGUNGSSTUFE 3 126 3.10.3 ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE UND
PROTEINSEQUENZIERUNG 127 4. DISKUSSION 130 4.1 KEIMLINGE UND
SUSPENSIONSKULTUREN - ZWEI MODELLSYSTEME FUER BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN
AN DER KIEFER 130 4.2 ENTWICKLUNG EINES ENZYMTESTS ZUM NACHWEIS DER
PINOSYLVIN- 3-O-METHYLTRANSFERASE 131 4.3 OZONINDUKTION DER
PINOSYLVINMETHYLTRANSFERASE UND DER STILBEN BIOSYNTHESE IN
KIEFERNKEIMLINGEN 133 4.4 WIRKUNG VON PINOSYLVIN UND
PINOSYLVINMETHYLETBER AUF KIEFERN KEIMLINGE UND ZELLKULTUREN 137 4.5
ELICITORINDUKTION DER STILBENBIOSYNTHESE IN KIEFERN-SUSPENSIONS KULTUREN
140 4.6 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PINOSYLVIN-3-O-METHYL-
TRANSFERASE 143 4.7 AUSBLICK 152 5. ZUSAMMENFASSUNG 153 5.1 INDUKTION
DER PINOSYLVIN-3-O-METHYLTRANSFERASE DURCH OZON UND ELICITOREN 153 5.2
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PINOSYLVIN-3-O-METHYL- TRANSFERASE
154 6. LITERATUR 155
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