Isolierung und Charakterisierung von Molybdat-Aufnahmemutanten bei Klebsiella pneumoniae:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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^ * N)
INHALTSVERZEICHNIS
A. ZUSAMMENFASSUNG
B. EINLEITUNG
1
.
BAKTERIELLE MOLYBDOENZYME UND MOLYBDAEN-KOFAKTORSYNTHESE
AUFNAHME VON MOLYBDAEN.
REGULATION DER AUFNAHME.
AUFGABENSTELLUNG.
C. MATERIAL UND METHODEN
1. MATERIAL.
1
.
1
.
1
.
2
.
1.3.
1.4.
2
5
8
.11
12
12
12
13
14
15
15
1.5.
1
.
6
.
1.7.
BAKTERIENSTAEMME UND PHAGEN.
PLASMIDE.
NAEHRMEDIEN.
PUFFER UND LOESUNGEN.
A) BAKTERIEN- UND PHAGEN-PUFFER.
B) PUFFER UND LOESUNGEN FUER DNA-ISOLIERUNGEN.
C) ENZYMREAKTIONSPUFFER.
D) PUFFER UND LOESUNGEN FUER AGAROSEGELE.
E) PUFFER UND LOESUNGEN FUER ACRYLAMIDGELE.
F) LOESUNGEN FUER DIE HYBRIDISIERUNG.
G) PUFFER FUER DIE QUIAGEN-SAEULEN.
ENZYME.
CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN.
.
GERAETE.
2. METHODEN.
2
.
1
.
2
.
2
.
2.3.
2.4.
2.5.
2
.
6
.
.21
21
2.7.
2
.
8
.
ANAEROBE ANZUCHT. -
A) ANAEROBIC SYSTEMS, BBL GASPAK.^
B) ANAEROCULT P, DIAGNOSTICA MERCK .
C) ANZUCHT UNTER ARGON
BZW.
STICKSTOFF-ATMOSPHAERE
TEST AUF NITRATREDUKTASE-AKTIVITAET.
A) NITRATREDUKTASE PLATTENTEST.
B) BESTIMMUNG DER NAR-AKTIVITAET DURCH NITRITBILDUNG UE/N.~
C) KINETISCHE MESSUNG DER NITRATREDUKTASE-AKTIVIAET.
TEST AUF FORMIATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET.
A) FORMIATDEHYDROGENASE-PLATTENTEST.
B) FORMIATDEHYDROGENASE-GASBILDUNGSTEST.
TEST AUF TRIMETHYLAMIN-N-OXIDOREDUKTASE-AKTIVITAET. FF
BESTIMMUNG DER NITROGENASE-AKTIVITAET.
DIREKTE MESSUNG DER MOLYBDAENAUFNAHME AM ICP-MS.^
A) REINIGUNG DER GEFAESSE.
B) ANZUCHT DER ZELLEN.
C) AUFARBEITUNG DER ZELLEN.
D) PROBENVORBEREITUNG.
E) MESSUNG AM ICP-MS.^
PLASMIDISOLIERUNG. ,
A) PLASMIDISOLIERUNG NACH BIMBOIM UND DOLY."
B) SEQUENZIER-LYSE.26
KLONANALYSE.
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/943841291
-II-
INHAITSVERZEICHNIS
A) E-LYSE. 26
B) YYCLEARED LYSATES". 26
C) KOCHMETHODE. 26
2.9. ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA. 27
2.10. ALKOHOLFALLUNG VON DNA 27
2.11. HYDROLYSE VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKIEASEN 27
2
.
12
. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 28
2.13. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSEGEL 28
2.14. NACL-GRADIENT. 28
2.15 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 ' PHOSPHAT-DNA-ENDEN 29
2.16. VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT T
4
-DNA-LIGASE. 29
2.17.
IN VITRO VERPACKUNG KONKATEMERER DNA 29
2.18. INFEKTION EINES BAKTERIENSTAMMES MIT EINEM
IN VITRO LYSAT 29
2.19. TRANSFORMATION VON
E. COLI
30
A) HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN. 30
B) TRANSFORMATION.
30
2.20. ELEKTROPORATION VON
K. PNEUMONIAE 30
2.21. KREUZUNG VON
E. COLI UND K. PNEUMONIAE 30
2.22. PI-TRANSDUKTION.
31
2.23. TN5-MUTAGENESE.
31
A) MIT X-PHAGEN. 31
B) MIT SUIZIDVEKTOREN
32
2.24. AUFREINIGUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN. 32
A) TRITYL-OFF-SYNTHESE.
32
B) ALF PRIMER-SYNTHESE.
32
2.25. MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT DIGOXIGENIN-LL-DUTP
33
2.
26
. SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG 33
A) NICKTRANSLATION MIT BIOTIN-7-DATP
33
B) TEST DER NICKTRANSLATION 33
C) DNA-TRANSFER MITTELS VAKUUMBLOT
34
D) VORHYBRIDISIERUNG. 34
E) HYBRIDISIERUNG. 34
F) WASCHUNGEN 35
G) NACHWEISREAKTION. 35
2.27. SEQUENZIERUNG MIT
32
P-MARKIERTER PROBE
35
A) DENATURIERUNG DER DS-DNA.
35
B) PRIMER-ANNEALING UND LABEL-REAKTION.
35
C) ACRYLAMID-HAMSTOFF-GELELEKTROPHORESES. 36
2.28. SEQUENZIERUNG MIT DEM A.L.F.-DNA SEQUENCER 36
A) PRIMER-ANNEALING. 35
B) KETTENABRUCHREAKTION 37
C) ACRYLAMID-HAMSTOFF-GELELEKTROPHORESE. 37
-III-
INHALTSVERZEICHNIS
D. ERGEBNISSE
.38
1. KONSTRUKTION EINES VEKTORS FUER DIE TN5-MUTAGENESE VON
K. PNEUMONIAE 38
2. ISOLIERUNG VON TN5-MUTANTEN MIT DEFEKTER MOLYBDATAUFNAHME.40
3. MESSUNG DER MOLYBDAENAUFNAHME PLEIOTROPER NICHT SUPPRIMIERBARER 43
MUTANTEN AM ICP-MS
4. KOMPLEMENTATION DURCH DURCH DAS MOD-OPERON VON E. COLI 49
5. CHARAKTERISIERUNG DER INAKTIVIERTEN GENE. 52
6. ANALYSE DER SEQUENZ DER MUTATIONSORTE G32, G3OEI UND X3. 55
7. FUNKTIONSANALYSE DER GENE.61
7.1. PI-TRANSDUKTION.61
7.2. INAKTIVIERUNG UND HOMOGENOTISIERUNG62
8
. SEQUENZANALYSE DES INTEGRATIONSORTES EINER E. COLI MUTANTE MIT .65
GLEICHEM PHAENOTYP
E. DISKUSSION
.72
ISOLATION UND CHARAKTERISIERUNG NEUARTIGER MUTANTEN IN DER
MOLYBDATAUFNAHME .73
MODELLVORSTELLUNGEN ZUR MOLYBDATAUFNAHME BEI IC. PNEUMONIAE UND E. COLI
78
F.
LITERATURVERZEICHNIS
.
83
G. ANHANG.
95
1
. SEQUENZ DER TN
5
-INTEGRATIONSORTE DER K. PNEUMONIAE MUTANTEN G
32
, G
301
95
UND X
3
2. SEQUENZ DES TN
5
-INTEGRATIONSORTES DER E. COLI MUTANTE M
22
98
3
. PLASMIDKONSTRUKTION VON PMG
9
.
101
H. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS. 102 |
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