DNA-Erkennung eines HTH-Proteins am Beispiel der Tn10-Tet-Repressor-tet-Operator-Wechselwirkung:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 1995 |
| Beschreibung: | IV, 125 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
2
2.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TET
OPERATOREN
IM
TETR/TERO-KOMPLEX
.
4
2.2.
STRUKTUR
DES
TET
REPRESSORS
.
6
2.3.
CHARAKTERISIERUNG
DES
AHELIX-TUM-AHELIX
MOTIVS
.
8
2.4.
DNA-BINDEMODUS
DES
AHELIX-TUM-AHELIX
MOTIVS
.
9
2.5.
MOLEKULARE
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
TETR
UND
TETO
.
10
2.6.
ZIELSETZUNG
.
11
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
3.1.
MATERIALIEN
.
12
3.1.1.
CHEMIKALIEN
.
12
3.1.2.
PROTEINE.
.
13
3.1.3.
HILFSMITTEL
.
14
3.1.4.
VERWENDETEN
GERAETE.
14
3.1.5.
BAKTERIENSTAEMME
.
15
3.1.6.
PLASMIDE
UND
PHAGEN.
.
15
3.1.7.
OLIGONUKLEOTIDE
.
17
3.2.
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
17
3.2.1.
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
17
3.3.
METHODEN
.
19
3.3.1.
TRANSFORMATION
.
19
3.3.I.I.
HERSTELLEN
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
.
19
3.3.I.2.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.COLI
ZELLEN
.
19
3.3.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
20
3.3.2.I.
ALKALISCHE
LYSE
ZUR
PLASMIDISOLIERUNG
IN
ANALYTISCHEN
MENGEN
.
20
3.3.2.2.
BRIJ-DOC
AUFSCHLUSS
ZUR
PLASMIDISOLIERUNG
IN
PRAEPARATIVEN
MENGEN
.
20
3.3.2.3.
CSCL
DICHTEGRADIENTEN
ZENTRIFUGATION
.
20
3.3.3.
METHODEN
ZUR
FAELLUNG
VON
DNA
.
21
3.3.3.I.
FAELLUNG
MIT
PEG
.
21
3.3.3.2.
FAELLUNG
MIT
ETHANOL
BZW.
ISOPROPANOL
.
21
3.3.4.
MODIFIZIERUNGSMETHODEN
VON
DNA
.
21
3.3.4.I.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
21
3.3.4.2.
RADIOAKTIVE
5
ENDMARKIERUNG
VON
DNA
MIT
F-P^PJ-ATP
.
21
3.3.4.3.
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
.
22
3.3.5.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
.
22
3.3.5.I.
ELUTION
VON
DNA
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
.
22
3.3.5.2.
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
22
3.3.5.3.
DE52-SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
22
3.3.6.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
22
3.3.6.I.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
NACH
SANGER
.
22
3.3.6.I.I.
DENATURIERUNG
VON
PLASMID-DNA
UND
PRIMERHYBRIDISIERUNG
.
22
3.3.6.1.2.
MARKIERUNG
UND
TERMINATION
.
23
3.3.6.2.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
NACH
MAXAM
&
GILBERT
.
23
INHALT
3.3.6.21.
G+A-REAKTION.
.
23
3.3.6.2.2.
T+C-REAKTION.
.
23
3.3.6.2.3.
G-REAKTION
.
23
3.3.OE.2.4.
SPALTUNG
DER
MODIFIZIERTEN
DNA
MIT
PIPERIDIN.
.
24
3.3.7.
ARBEITEN
MIT
M13
PHAGEN
.
24
3.3.7.1.
ANZUCHT
VON
M13
PHAGEN
.
24
3.3.7.2.
M13
PHAGEN-PLATTIERUNG
.
24
3.3.7.3.
ANALYTISCHE
M13
EINZELSTRANG-DNA-PRAEPARATION.
.
24
3.3.7.4.
PRAEPARATIVE
M13
EINZELSTRANGPRAEPARATION
.
25
3.3.8.
OLIGOMIKLEOTIDGERICHTETE
MUTAGENESEN
.
25
3.3.8.1.
MUTAGENESE
MIT
OLIGONUKLEOTIDKASSETTEN.
.
25
3.3.8.2.
MUTAGENESE
MIT
STRANGSELEKTION
DURCH
URACIL-HALTIGE
DNA.
.
25
3.3.8.2.I.
PRAEPARATION
URACIL-HALTIGER
EINZELSTRAENGIGER
M13
DNA.
.
25
3.3.8.2.2.
MUTAGENESE
MIT
HETERODUPLEX-DNA
.
26
3.3.9.
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
NACH
MILLER.
.
26
3.3.9.I.
ANZUCHT
DER
ZELLEN.
.
26
3.3.9.2.
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
.
27
3.3.10.
METHODEN
ZUR
ANALYSE
DER
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNG.
.
27
3.3.10.1.
GELMOBILITAETSANALYSE
.
27
3.3.10.2
METHYLIERUNGSSCHUTZANALYSE
.
27
3.3.10.3.
HYDROXYLRADIKAL-SCHUTZANALYSE
.
28
3.3.11.
AUFREINIGUNG
VON
TET
REPRESSORPROTEIN
.
28
3.3.11.1.
ANZUCHT
DER
E.COH
ZELLEN
ZUR
PROTEINUEBEREXPRESSION
.
28
3.3.11.2.
AUFSCHLUSS
DER
ZELLEN
UND
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFREINIGUNG
DES
PROTEINS
.
28
3.3.12.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
TET
REPRESSOR
AUS
ZELLROHEXTRAKTEN
.
29
3.3.12.1.
ZELLAUFSCHLUSS
FUER
PROTEINROHEXTRAKTE.
29
3.3.12.2.
WESTEMBLOT
.
29
3.3.12.3.
IMMUNFAERBUNG.
30
3.3.12.3.1.
IMMUNFAERBUNG
MIT
GEKOPPELTER
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
.
30
3.3.12.3.2.
IMMUNFAERBUNG
MIT
GEKOPPELTER
PEROXIDASE
.
30
4.
ERGEBNISSE
31
4.1.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
VON
TYROSIN
42,
TRYPTOPHAN
43
UND
HISTIDIN
44
FUER
DIE
BINDUNG
AN
TET
OPERATOR
.
31
4.1.1.
DARSTELLUNG
VON
REPRESSORMUTANTEN
MIT
EINZELNEN
AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN.
31
4.1.1.1,
KASSETTENMUTAGENESE
AN
KODON
42,43
UND
44
.
31
4.1.1.2.
DARSTELLUNG
DER
TET
REPRESSORMUTANTE
WN43
.
33
4.1.2.
UMKLONIERUNG
DER
MUTIERTEN
TERR
GENE
AUS
PWH1411
IN
PWH510
UND
PWH520
.
33
4.1.3.
IN
VIVO
SYSTEME
ZUR
ANALYSE
DER
REPRESSOR
ITET
OPERATOR-WECHSELWIRKUNGEN.
36
4.1.4.
BINDUNG
VON
TET
REPRESSORMUTANTEN
YX42,
WX43
UND
HX44
AN
WT
TETO
.
38
4.I.4.I.
BINDUNG
VON
YX42
AN
WT
TETO
.
38
4.1.4.2.
BINDUNG
VON
WX43
AN
WT
TETO
.
40
4.1.4.3.
BINDUNG
VON
HX44
AN
WT
TETO
.
40
4.1.5.
GEGENUEBERSTELLUNG
DER
ZELLULAEREN
PROTEINMENGEN
ZWISCHEN
DEN
REPRESSORMUTANTEN
UND
WT
TETR.
.
40
4.1.6.
INDUZIERBARKEIT
VON
OPERATOR-BINDENDEN
TET
REPRESSORMUTANTEN
.
41
4.1.7.
TRANSDOMINANZ
VON
OPERATOR-BINDE-INAKTIVEN
TET
REPRESSORMUTANTEN
.
42
4.1.8.
HYDROXYLRADIKALSCHUTZ-ANALYSE
VON
WT
TETO
MIT
AN
POSITION
42,
43
UND
44
MUTIERTEN
REPRESSOREN
.
44
4.1.9.
IN
VIVO
BINDUNG
DER
TET
REPRESSORMUTANTEN
42YX,
43WX
UND
44HX
AN
OPERATORVARIANTEN
.
45
4.1.9.1.
EINFACHE
OPERATOR-BINDEPROFILE
.
47
4.I.9.2.
KOMPLEXE
OPERATOR-BINDEPROFILE
.
49
4.2.
SELEKTION
VON
TET
REPRESSORMUTANTEN
MIT
EINER
GEGENUEBER
DEN
AUSGANGSMUTANTEN
PQ39
UND
YM42
ERHOEHTEN
AFFINITAET
FUER
TETO-4C
.
52
INHALT
4.2.1.
DARSTELLUNG
VON
TET
REPRESSONNUTANTEN
MIT
KOMBINATORISCHEN
AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN
.
53
4.2.2.
FUNKTIONSWEISE
DES
SELEKTIONSSYSTEMS
ZUM
AUFIINDEN
MO-4C-BINDENDER
REPRESSORMUTANTEN
.
54
4.2.3.
DARSTELLUNG
DES
PLASMIDS
PWH414-4C
.
55
4.2.4.
EINSTELLEN
DER
SELEKTIONSBEDINGUNGEN
FUER
TETO-4C
.
55
4.2.5.
ERGEBNISSE
AUS
DEM
SELEKTIONSSYSTEM
E.COLI
V/H202-XVI132S
X
PWH414-4C
.
58
4.2.5.I.
DARSTELLUNG
DER
TET
REPRESSONNUTANTEN
PQ39LV41
UND
EA37PQ39
.
60
4.2.5.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
BINDESPEZIFITAET
VON
DEN
GEFUNDENEN
TET
REPRESSONNUTANTEN
FURTE/O-4C
.
60
4.2.5.2.I.
CHARAKTERISIERUNG
DER
REPRESSONNUTANTEN
PQ39LV41YM42
UND
LV41YM42
.
61
4.2.5.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
REPRESSORMUTANTEN
MIT
EINEM
ZUSAETZLICHEN
EA37AUSTAUSCH.
62
43.
IN
VITRO
ANALYSE:
BESTIMMUNG
DER
BASENPOSITIONEN
VON
TETO
INNERHALB
DER
GROSSEN
FURCHE,
WELCHE
IN
UNMITTELBARER
NACHBARSCHAFT
VON
TETR
LIEGEN
.
66
4.3.1.
AUFBEREITUNG
DER,
FUER
DIE
IN
VITRO
ANALYSEN
EINGESETZTEN
PROTEIN
UND
DNA
KOMPONENTEN
.
68
43.1.1.
PRAEPARATION
DER
SPEZIFISCHEN
DNA-FRAGMENTE
.
68
4.3.I.2.
PROTEINAUFREINIGUNG
VON
WT
TET
REPRESSOR
UND
EINIGER
REPRESSONNUTANTEN
.
68
4.3.2.
GELMOBILITAETSEXPERIMENTE
ZUR
ANALYSE
DER
SEQUENZSPEZIFITAET
DER
SICH
AUSBILDENDEN
TETR/TETO
KOMPLEXE
.
70
4.3.3.
HYDROXYLRADIKALSCHUTZEXPERIMENTE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
LAGE
VON
TETR
AN
TETO
.
72
4.3.3.
1.
WT
TETR/TERO
KOMPLEX
.
73
4.3.3.2.
WT
TETR/TE/O-X
KOMPLEXE
.
75
4.3.3.3.
MUTIERTE
TETR/TETO-X
KOMPLEXE
.
76
4.3.4.
METHYLIERUNGSSCHUTZEXPERIMENTE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
NACHBARSCHAFT
VON
TETR
ZU
GUANINEN
IN
DER
GROLLEN
FURCHE
VON
TETO
.
80
4.3.4.I.
METHYLIERUNGSSCHUTZ
AN
TERO-X
DURCH
WT
TETR.
.
81
4.3.4.2.
METHYLIERUNGSSCHUTZ
AN
TETO-X
DURCH
REPRESSONNUTANTEN.
.
83
5.
DISKUSSION
86
5.1.
NACHBARSCHAFT
VON
TETR
ZU
EINZELNEN
BASENPOSITIONEN
INNERHALB
VON
TETO
86
5.1.1.
SPEZIFITAET
DER
TETR/TETO-X
KOMPLEXE
.
86
5.1.2.
LOKALISATION
VON
TETR
AN
TETO-X
.
87
5.1.3.
METHYLIERUNGSSCHUTZ
AN
DEN
GUANINSONDEN
VON
TETO-X
.
88
5.13.1.
METHYLIERUNGSSCHUTZ
DURCH
WT
TETR.
.
88
5.I.3.2.
METHYLIERUNGSSCHUTZ
DURCH
REPRESSONNUTANTEN
.
88
5.1.4.
STRUKTURELLE
INTERPRETATION
DIESER
ERGEBNISSE
.
89
5.2.
FUNKTION
VON
TYROSIN
42,
TRPTOPHAN
43
UND
HISTIDIN
44
BEI
DER
AUSBILDUNG
DES
TETR/RERO-KOMPLEXES
.
91
5.2.1.
STRUKTURELLE
BEDEUTUNG
DES
CARBOXYTERMINALEN
BEREICHS
DER
ERKENNUNGSHELIX
FUER
DIE
AUSBILDUNG
DES
TETR/TERO
KOMPLEXES.
.
92
5.2.2.
TYROSIN
42
.
93
5.2.2.1.
BINDEEIGENSCHAFTEN
VON
YX42
AN
TETO
.
93
S.2.2.2.
SEQUENZSPEZIFISCHE
BINDEEFFEKTE
VON
YX42
.
94
5.2.3.
TRYPTOPHAN
43
.
97
5.2.3.1.
BINDEEIGENSCHAFTEN
VON
WX43
AN
TETO
.
97
5.23.2.
SEQUENZSPEZIFISCHE
BINDEEFFEKTE
VON
WX43
.
98
5.2.4.
HISTIDIN
44
.
102
5.2.4.1.
BINDEEIGENSCHAFTEN
VON
HX44
AN
TETO
.
102
5.2.4.2.
SEQUENZSPEZIFISCHE
BINDEEFFEKTE
VON
HX44
.
103
INHALT
5.3.
SPEZIFITAETS
UND
AFIINITAETSERHSSHUNG
VON
PQ39
FUER
TETO-4C
DURCH
ZUSAETZLICHE
AMINOSAEUREAUSTAUSCHE
.
106
5.3.1.
5.3.2.
5.3.2.I.
GEGENSEITIGER
EINFLUSS
VON
VAL41
UND
MET42
BEI
DER
BINDUNG
VON
TETR
AN
TETO
106
EINFLUSS
VON
ALA
37
AUF
DIE
BINDUNG
VON
TETR
AN
TETO
.
107
SEQUENZSPEZIFISCHER
EINFLUSS
VON
ALA37
AUF
DIE
BINDUNG
DER
REPRESSORMUTANTE
YM42
AN
TE/O-4C
.
108
5.3.2.2.
SEQUENZSPEZIFISCHER
EINFLUSS
VON
ALA37
AUF
DIE
BINDUNG
DER
REPRESSORMUTANTE
PQ39
AN
TETOAC
.
109
S.3.2.3.
EINFLUSS
VON
EA37YM42
AUF
DIE
SPEZIFITAET
DER
REPRESSORMUTANTE
PQ39
FUER
RE(O-4C
110
5.4.
BEDEUTUNG
VON
BPL
FUER
DIE
AUSBILDUNG
DES
TETR/TETO-KOMPLEXES
.
111
5.5.
MODELL
ZUR
TETR/TETO
WECHSELWIRKUNG
.
112
5.6.
DNA-BINDEMODUS
VON
TETR
AN
TETO
.
114
6.
LITERATUR
6
ANHANG
M |
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