Der Abbau von Glucose in Trophozoiten von Giardia lamblia: Darstellung und biochemische Charakterisierung von Hexokinase, Glucosephosphat-Isomerase und PPi-Phosphofructokinase
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
Seite
1.0 EINLEITUNG 6
11 DieGIykolyse 6
II I Hexokinase 8
1.1.2 Glucosephosphat Isomerase 10
1.1.3 PPi Phosphofructokinase 12
12 Glucosemetabolismus in Giardia lamblia 14
13 Problemstellung 16
2.0 MATERIAL UND METHODEN 17
2.1 Materialien 17
2.2 Präparative Darstellung von Heiokiaase, Glucosephosphat
Isomerase und PPrPhosphofnietoiuaase aus (7. lamNia 18
2.2.1 Zellkultur 18
2.2.2 Homogenatüberstand 19
223 Gdfiltration an Fractogd TSK HW 55 (F) 20
2 24 Gelfiltration an Ultrogd AcA 34 20
2.2.5 lonenaustauscbchromatographiean DEAE Cellulose 20
22.6 Kovalente Chromatographie an Affigel 501 21
2.2.7 Affinitätschromatographie an Bhie Sepharose CL 6B 21
2.2.8 Aufbewahren der Enzympraparate 22
2.3 Proteinbestimmungen 23
2.3.1 Proteinbestimmung nach Bradford 23
2.3.2 Proteinbestimmung nach Lowry 23
2.4 Aktrvitätsbestinmungen der Enzyme 24
2.4.1 Die Bestimmung der Hexokinase Aktivität 24
24.2 I)ie Bestimmung der Ghicosephosphat Isomerase Aktivität 26
2.4.2.1 Farbentwicklung mit Resorcin 26
2.4.2.2 Gekoppelter optischer Test mit Hilfe der Ghicose 6
phosphat Dehydrogenase 28
2.4.3 Die Bestuiiimirig aer PPrPhosphofructokinase Aktivität 29
2.5 Enzymologische Charakterisierung von Hexokinase,
Ghicosephosphat Isooterase und PPrPhosphofructokiMse 30
2.5.1 Die Bestimmung der Temperatur und pH Optima der Enzyme 30
25.2 Die Bestimmung des ATP Umsatzes der Hexokinase durch HPLC 31
2.5.3 Die Bestimmung der Substratspezifitüten 31
2.5.4 Die Bestimmung der Michaeliskonstanten (KM) und der
Wechselzahlen (1c*) der untersuchten Enzyme aus G. lamblia 32
2.5 5 Der Einfluß von Effektoren 33
2.6 Molekulare Eigenschaften 35
2.6.1 Isoelektrische Fokussierung 35
2.6.2 Die Bestimmung der relativen Molekularmassen der Enzyme
durch Gelausschlußchromatographie 36
2.6.3 Die Bestimmung der relativen Molekularmasseti der Enzyme
durch SDS GeWekirophorese 36
2.6.4 Polyacrylamid Gelelektrophoresen unter nicht denaturierenden
Bedingungen 38
3.0 ERGEBNISSE 42
3.1 Präparation der Enzyme aus Giardia lamblia 42
3.1.1 Nachweis der Hexokinase , Glucosephosphat Isomerase und
PPi Phosphofructokinase Aktivitäten im Zellhomogenat 43
3.1.2 Ultrazentrifiigation 43
3 13 Gelfiltration an Fractogel TSK HW 55 (F) 44
3.1 4 Gelfiltration an Ultrogel AcA 34 44
3.1.5 Ionenaustauschchromatographie an DEAE Cellulose 47
3.1.6 Kovalente Chromatographie an Affigel 501 50
3.1 7 Affinitätschromatographie an Blue Sepharose CL 6B 52
3.2 Charakterisierung der Enzyme 54
3.2.1 Molekulare Eigenschaften 54
3.2. 1.1 Die Bestimmung der isoelektrischen Punkte der Enzyme
durch isoelektrische Fokussierung 54
3 2.1.2 Die Bestimmung der relativen Molekularmassen durch
Ultrogel AcA 34 und SDS Gelelektrophorese 55
3 2 13 Polyacrylamid Geleleklrophoresen unter nicht
denaturierenden Bedingungen 55
5
3.3 Enzymologische Eigenschaften von llexokinase, Glurosephosphat
Isomerase und PPi Phosphofructokinase aus (1. lamblia 59
3.3.1 Die Temperatur Abhängigkeit der Enzymaktivitäten 59
332 Die pH Abhängigkeit der Enzymaktivitäten 62
333 Die Bestimmung des ATP Umsatzes der Hexokinase mittels HPLC 65
334 Die Substratspezifität der Hexokinase 67
3 3 5 Die Substratspezifitäten der Glucosephosphat Isomerase und
PPi Phosphofructokinase 68
3.36 Die Bestimmung der Michaeliskonstanten (Km) und der
Wechselzahlen (Itd) der untersuchten Enzyme 69
3.3.7 Der Einfluß von Effektoren auf die Enzymaktivitäten 73
3 3 8 Der Einfluß unterschiedlicher Effektorkonzentrationen
auf die Enzymaktivitäten 75
4.0 DISKUSSION 77
4.1 Präparative Darsellung von Hexokinase, Glucosephosphat
Isomerase und PPj Phosphofhictokinase aus G. lamblia 77
4.2 Molekulare Eigenschaften der Enzyme aus G. lamblia 80
4.2.1 Hexokinase 80
4.2.2 Glucosephosphat Isomerase 80
4.2.3 PP, Phosphofructokinase 81
4.3 Enzymologische Charakterisierung der Enzyme aus G. lamblia 83
4.3.1 Hexokinase 83
4.3.2 Glucosephosphat Isomerase 84
4.3.3 PPi Phosphofructokinase 86
4.3.3.1 Warum PPi abhängige Glykolyse 88
5.0 ZUSAMMENFASSUNG 92
6.0 TABELLE DER ABKÃœRZUNGEN 94
7.0 LITERATURVERZEICHNIS 95
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