Untersuchungen zur Reifung und Aktivierung der Hydrogenasen von Escherichia coli:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
1
I.
EINBAU
VON
METALLIONEN
IN
PROTEINE
1
N.
DIE
BEDEUTUNG
VON
NICKEL
ALS
ESSENTIELLES
SPURENELEMENT
6
IN.
DIE
HYDROGENASEN
VON
ESCHERICHIA
COLI
8
IV.
GENETISCHE
ORGANISATION
DER
HYDROGENASEOPERONEN
10
MATERIAL
UND
METHODEN
17
1.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
17
1.1
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
BAKTERIOPHAGEN
17
1.2
NAEHRMEDIEN
UND
PUFFER
22
1.3
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
UND
VERMEHRUNG
VON
PHAGEN
23
2.
GENETISCHE
METHODEN
24
2.1
PL-TRANSDUKTION
24
2.2
ERZEUGUNG
CHROMOSOMALER
DELETIONEN
24
3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
24
3.1
DNA-ISOLIERUNG
24
3.2
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
3.2.1
IN
V/7RO-TECHNIKEN
MIT
DNA
24
3.2.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
ZELLEN
25
3.3
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
PCR
~
25
3.4
DNA-SEQUENZIERUNG
25
3.5
LISTE
VERWENDETER
OLIGONUKLEOTIDE
25
4.
ANALYTISCHE
STANDARDMETHODEN
26
4.1
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
UND
PROTEINEN
26
4.1.1
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
26
4.1.2
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELEN
26
4.1.3
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
26
4.2
PROTEINBESTIMMUNG
27
4.3
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
27
4.4
SZINTILLATIONSMESSUNG
28
4.5
SEQUENZIERUNG
DES
N-TERMINUS
VON
PROTEINEN
28
5.
PHYSIOLOGISCHE
METHODEN
28
5.1
QUALITATIVER
TEST
AUF
UREASEAKTIVITAET
28
5.2
QUALITATIVER
TEST
AUF
GASBILDUNG
28
5.3
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
FORMIATDEHYDROGENASE
H
UND
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
29
5.4
NACHWEIS
VON
HYDROGENASEAKTIVITAET
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
29
5.5
IN
V/FRO-PROZESSIERUNG
VON
HYCE
IN
AYP-MUTANTEN
29
6.
MARKIERUNG
VON
HYCE
MIT
NI
30
7.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
SAEURELABILEM
SCHWEFEL
IN
HYPD
30
8.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
31
8.1
IMMUNBLOT-ANALYSEN
31
8.2
ROCKET-IMMUNELEKTROPHORESE
31
8.3
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
GEGEN
HYPC,
HYPD
UND
HYPE
31
8.4
PRAEPARATION
UND
REINIGUNG
VON
IGG-FRAKTIONEN
AUS
BLUTSEREN
32
8.4.1
PRAEPARATION
DER
IGG-FRAKTIONEN
32
8.4.2
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
IGG-FRAKTIONEN
32
8.5
IMMUNGOLD-MARKIERUNGEN
VON
ULTRADUENNSCHNITTEN
VON
E.
COLI
ZELLEN
3
3
9.
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
33
9.1
EXPRESSION
KLONIERTER
GENE
IN
E.
COLI
33
9.1.1
EXPRESSION
VON
HYPD
MIT
HILFE
DES
PT7-PLASMIDSYSTEMS
33
9.1.2
EXPRESSION
VON
HYPC,
HYPE,
SOWIE
DES
FUER
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
CODIERENDEN
GENS
GST
MIT
HILFE
DES
PGEX-PLASMIDSYSTEMS
33
9.2
REINIGUNG
DES
AYPD-GENPRODUKTS
34
9.2.1
PRAEPARATION
VON
ZELLFREIEM
EXTRAKT
34
9.2.2
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG
34
9.2.3
ENTSALZUNG
DER
PROTEINLOESUNG
34
9.2.4
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
AN
Q
SEPHAROSE
FAST
FLOW
35
9.2
5
HYDROPHOBE
INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE
(HIC)
AN
PHENYL
SUPEROSE
HR
5/5
35
9.2.6
GELFILTRATION
AN
SUPERDEX
75
PG
(HILOAD
16/60)
35
9.3
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
HYPC-GST,
HYPE-GST
UND
GST
35
9.3.1
PRAEPARATION
VON
ZELLFREIEM
EXTRAKT
35
9.3.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
GLUTATHION
SEPHAROSE
4B
36
36
10.
THROMBINOLYTISCHE
SPALTUNG
VON
HYPC-GST
11.
LOKALISATION
UND
GROESSENBESTIMMUNG
DER
ETYP-KOMPONENTEN
36
11.1
PRAEPARATION
CYTOPLASMATISCHER
UND
MEMBRANGEBUNDENER
PROTEINE
36
11.2
LOKALISATION
37
11.3
GROESSENBESTIMMUNG
DER
HYP-KOMPONENTEN
DURCH
GELFILTRATION
37
12.
COMPUTERUNTERSTFITZTE
ANALYSEN
VON
PROTEINSEQUENZEN
37
13.
BEZUGSQUELLEN
VON
REAGENZIEN
UND
CHROMATOGRAPHIE-MATERIALIEN
38
ERGEBNISSE
39
1.
EFFEKTE
VON
MUTATIONEN
IN
GENEN
DES
HYP-OPERONS
AUF
KOMPONENTEN
DES
FHL-KOMPLEXES
VON
ESCHERICHIA
COLI
39
1.1
KONSTRUKTION
VON
DELETIONSMUTANTEN
3
9
1.2
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DELETIONSMUTANTEN
41
1.2.1
QUALITATIVER
TEST
AUF
GASBILDUNG
41
1.2.2
QUALITATIVER
TEST
ZUR
KOMPLEMENTATION
DES
FHL-DEFEKTS
IN
AYP-MUTANTEN
DURCH
UREASE-GENE
42
1.2.3
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
FORMIATDEHYDROGENASE
H
UND
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
44
1.2.4
DIFFERENTIELLE
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
46
1.2.5
UNTERSUCHUNG
DER
PROZESSIERUNG
DER
GROSSEN
UNTEREINHEITEN
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
DURCH
INUNUNBLOT
51
1.3
EINBAU
VON
$^NI
IN
HYCE
54
1.3.1
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
INKORPORATION
VON
^NI
IN
HYCE
54
1.3.2
ANALYSE
DES
^NI-GEHALTES
VON
HYCE
IN
MUTANTEN,
DIE
DELETIONEN
IN
HYP-GENEN
TRAGEN
55
1.3.3
UNTERSUCHUNG
DER
NICHT
MIT
HYCE
KORRELIERBAREN
^NI-SIGNALE
58
2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IN
VITRO-AKTIVIERUNG
VON
HYDROGENASEN
IN
E
COLI
63
2.1
VERSUCH
ZUR
AUFSTELLUNG
EINES
IN
V/TRO-REKONSTITUTIONSASSAYS
FUER
HYDROGENASEAKTIVITAET
AUS
ROHEXTRAKTEN
VON
IIYP-DELETIONSMUTANTEN
63
2.2
VERSUCHE
ZUM
IN
VITRO-EINBAU
VON
^NI
64
2.3
KINETIK
DER
PROZESSIERUNGSREAKTION
VON
HYCE
IN
VITRO
65
3.
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
DER
GENPRODUKTE
HYPC,
HYPD
UND
HYPE
65
3.1
STRUKTURELLE
BESONDERHEITEN
DER
HYPD-SEQUENZ
65
3.2
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
DES
FYPD-GENPRODUKTES
66
3.3
IDENTIFIZIERUNG
VON
FE/S-ZENTREN
IN
HYPD
69
3.4
VERSUCHE
ZUM
ELEKTRONENTRANSFER
DURCH
HYPD
72
3.5
STRUKTURELLE
BESONDERHEITEN
DER
HYPC-UND
HYPE-SEQUENZEN
73
3.6
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
HYPC-GST
UNDHYPE-GST
73
3.6.1
KLONIERUNG
VON
HYPC
UND
HYPE
IN
FRAME
AN
DAS
FUER
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
CODIERENDE
GEN
GST
DER
VEKTOREN
PGEX-2T
UND
PGEX-3X
74
3.6.2
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
HYPC-GST
UND
HYPE-GST
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
76
3.6.3
PHYSIOLOGISCHE
TESTS
MIT
HYPC-GST
78
4.
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
UND
MOEGLICHEN
INTERAKTION
VON
HYPC,
D
UND
E
80
4.1
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
GEGEN
HYPD,
HYPC-GST
UND
HYPE-GST
80
4.2
PRAEPARATION
UND
ANREICHERUNG
SPEZIFISCHER
IGG-FRAKTIONEN
80
4.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
HYPD
IN
E.
COLI
ZELLEN
81
4.4
SUBZELLULAERE
VERTEILUNG
VON
HYPC,
D
UND
E
81
4.4.1
UNTERSUCHUNG
SUBZELLULAERER
FRAKTIONEN
DURCH
IMMUNBLOT
81
4.4.2
IMMUNGOLD-MARKIERUNGEN
VON
ULTRADUENNSCHNITTEN
VON
E.
COLI
MC4100
ZELLEN
MIT
AHYPD-ANTIKOERPEM
83
4.5
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN,
NATIVEN
MOLEKUELMASSEN
VON
HYPC,
D
UND
E
84
5.
EXPRESSION
VON
KOMPONENTEN
DES
APP-OPERONS
UND
DER
HYDROGENASE
STRUKTURGENCLUSTER
86
5.1
SYNTHESE
VON
HYPC
UND
D
UNTER
DEM
EINFLUSS
VON
DELETIONEN
IM
AYP-OPERON
86
5.2
SYNTHESE
DER
GROSSEN
UNTEREINHEITEN
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
SOWIE
VON
HYPC
UND
HYPD
UNTER
DEM
EINFLUSS
VON
O2,
NOJ",
FORMIAT
UND
VON
MUTATIONEN
IN
GENEN,
DIE
FUER
HYDROGENASESPEZIFISCHE
REGULATORPROTEINE
CODIEREN
87
6.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
APP-GENE
AUS
ALCALIGENES
EUTROPHUS
IN
E.
COLI
90
6.1
SEQUENZVERGLEICH
DER
AJP-GENPRODUKTE
VON
A.
EUTROPHUS
UND
E.
COLI
90
6.2
KLONIERUNG
DER
A.
EUTROPHUS
HYP-GENE
IN
DIE
FUER
KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE
GEEIGNETEN
VEKTOREN
PACYC184
UND
PBR322
92
6.3
QUALITATIVER
TEST
AUF
GASBILDUNG
93
6.4
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
FORMIATDEHYDROGENASE
H
UND
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
94
6.5
IMMUNBLOT-ANALYSEN
99
6.5.1
PROZESSIERUNG
DER
GROSSEN
UNTEREINHEITEN
DER
HYDROGENASEN
1,
2
UND
3
VON
E.
COLI
99
6.5.2
KREUZREAKTION
MIT
GEGEN
HYPB,
C,
D
UND
E
GERICHTETEN
ANTISEREN
100
DISKUSSION
102
ZUSAMMENFASSUNG
116
LITERATURVERZEICHNIS
119
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