Biochemische Untersuchung der Synthese der K5-Kapsel von Escherichia coli: Identifizierung der UDP-Glucose-Dehydrogenase und Glycosyltransferasen der K5-Kapselbiosynthese
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss., 1994 |
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1
EINLEITUNG
.
1
1.1
BAKTERIEN
UND
IHRE
ANTIGENE
.
1
1.1.1
DER
ZELLWANDAUFBAU
.
2
1.1.1.1
DER
ZELLWANDAUFBAU
GRAM-POSITIVER
BAKTERIEN
UND
DIE
MUREINSCHICHT
.
2
1.1.1.2
ZELLWANDAUFBAU
GRAM-NEGATIVER
BAKTERIEN
.
3
1.1.2
DIE
LIPOPOLYSACCHARIDE
(O-ANTIGENE)
.
4
1.1.3
DIE
KAPSELPOLYSACCHARIDE
(K-ANTIGENE)
.
5
1.2
KAPSELANTIGENE
VON
ESCHERICHIA
COLI.
.
5
1.2.1
KAPSELN
DER
GRUPPE
1
.
7
1.2.2
KAPSELN
DER
GRUPPE
II
.
7
1.2.3
DIE
ROLLE
DER
KAPSEL
IM
INFEKTIONSPROZESS
.
8
1.3
DAS
K5-KAPSELANTIGEN
AUS
E.
COLI
.
1
0
1.3.1
STRUKTUR
DES
K5-ANTIGENS
.
10
1.3.2
GENETIK
DER
K5-KAPSELBIOSYNTHESE
.
11
1.3.3
EXPRESSION
DER
K5-KAPSEL
.
1
3
1.3.3.1
DIE
POLYMERISATIONSREAKTION
DES
K5
POLYSACCHARIDS
.
1
3
1.3.3.2
DER
EXPORT
UND
DIE
EXPRESSION
DES
K5-KAPSELPOLYSACCHARIDS
.
1
4
1.4
ZIEL
UND
AUFGABENSTELLUNG
DER
ARBEIT
.
1
5
2
UNTERSUCHUNGEN
UND
ERGEBNISSE
.
1
6
2.1
BAKTERIEN
.
1
6
2.1.1
E.
COLI
WILDSTAEMME
.
1
6
2.1.2
E.
COLI
LABORSTAEMME
.
1
6
2.1.3
E.
COLI
KLONE
.
1
6
2.2
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
KAPSELPOLYSAC
CHARIDE
.
1
6
2.2.1
ISOLIERUNG
DES
POLYSACCHARIDS
AUS
DER
KAPSEL
.
19
2.2.2
ISOLIERUNG
DES
PERIPLASMATISCHEN
POLYSACCHARIDS
.
1
9
2.2.3
ISOLIERUNG
DES
POLYSACCHARIDS
AUS
DEM
ZYTOPLASMA
.
2
0
2.2.4
REINIGUNG
DER
KAPSELPOLYSACCHARIDE
AN
DETOXIGEL
.
21
2.2.5
ANALYSE
DER
GROESSE
DER
K5-POLYSACCHARIDE
DURCH
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
UND
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE).
21
2.2.6
UNTERSUCHUNG
DER
K5-POLYSACCHARIDE
AUF
SUBSTITUTION
MIT
KDO
.
2
4
2.2.7
UNTERSUCHUNG
DER
K5-POLYSACCHARIDE
AUF
LIPIDSUBSTITUTION
.
2
7
2.3
UNTERSUCHUNGEN
DER
K5-BIOSYNTHESEAKTIVITAET
DER
MEMBRANEN
.
28
2.3.1
UNTERSUCHUNG
DER
GLYCOSYLTRANSFERASE
AKTIVITAET
MIT
EXOGENEM
K5-POLYSACCHARID
.
29
2.3.1.1
ZEITABHAENGIGE
VERTEILUNG
DES
EINBAUS
IN
SEDIMENTIERBARE
UND
NICHT
SEDI
MENTIERBARE
FRAKTION
.
34
2.3.1.2
K5-POLYSACCHARID
NACH
MILDER
HYDROLYSE
ALS
EXOGENER
AKZEPTOR
.
35
2.3.2
SUBSTRATE
FUER
DIE
UDP-GLUCURONYLTRANSFERASE
(GLUCURONYL-AKZEPTOREN)
.
3
6
2.3.2.1
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
DES
K5-POLY
SACCHARIDS
.
37
2.3.2.2
ABSPALTUNG
DER
UNGESAETTIGTEN
GLUCURONSAEURE
VOM
NICHT
REDUZIER
ENDEN
ENDE
.
37
2.3.3
SUBSTRATE
FUER
DIE
N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANS
FERASE
(N-ACETYLGLUCOSAMINYL-AKZEPTOREN)
.
3
9
2.3.4
IN
VITRO
VERLAENGERUNG
VON
K5-POLYSACCHARID
UND
OLIGOSACCHARIDEN
.
4
2
2.3.4.1
VERLAENGERUNG
DER
EXOGENEN
AKZEPTOREN
.
4
2
2.3.4.2
ZAHL
DER
UEBERTRAGENEN
ZUCKERBAUSTEINE
.
4
3
2.4
ISOLIERUNG
DER
UDPG-DEHYDROGENASE
.
47
2.4.1
EXPRESSION
DES
ORF44
DER
REGION
2
ALS
GENFUSION
.
47
2.4.1.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
VON
ORF44
UND
REINIGUNG
DES
GEN
PRODUKTES
.
48
2.4.1.2
VERDAU,
DEPHOSPHORYLIERUNG
UND
LIGA
TION
DES
PCR
PRODUKTES
IN
DEN
VEKTOR
PGEX-2T
.
51
2.4.1.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
SURE
BZW.
JM101
.
53
2.4.1.4.
KONTROLLE
DER
RICHTIGEN
ORIENTIERUNG
.
53
2.4.1.5
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
JM101
MIT
DEM
PLASMID
PVS1
.
55
2.4.2
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
GLUTATHION
TRANSFERASE-P44-FUSIONSPROTEINS
.
5
5
2.4.3
SPALTUNG
DES
GST-P44-FUSIONSPROTEINS
MIT
THROMBIN
.
5
7
2.4.4
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
DES
GESPALTENEN
P44
PROTEINS
UND
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
.
57
2.4.5
UDP-GLUCOSE
DEHYDROGENASEAKTIVITAET
DES
GST
P44-FUSIONSPROTEINS
UND
SPALTPRODUKTES
.
59
2.4.6
GEWINNUNG
EINES
ANTISERUMS
GEGEN
DAS
GST
P44-FUSIONSPROTEIN
.
61
2.4.7
EXPRESSION
DES
ORF44
IN
E.
COLI
JM105(PGPR105D)
.
61
2.4.8
LOKALISIERUNG
DER
UDP-GLUCOSE-DEHYDROGENASE
IN
DER
BAKTERIENZELLE
.
62
2.4.9
ISOLIERUNG
DER
UDP-GLUCOSE
DEHYDROGENASE
DURCH
ANTIKOERPER-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
64
2.4.10
AKTIVITAET
DER
UDP-GLUCOSE
DEHYDROGENASE
.
66
2.5
IDENTIFIZIERUNG
DES
P60
ALS
DIE
GLYCOSYLTRANSFERASEN
DER
K5-BIOSYNTHESE
.
68
2.5.1
INDUKTION
VON
E.
COLI
JM109(PGPR106M)
UND
JM109(PGPR106C)
UND
ANALYSE
DER
PRODUKTE
.
68
2.5.2
GLYCOSYLTRANSFERASEAKTIVITAET
VON
P60
.
69
2.5.3
N-TERMINALE
SEQUENZBESTIMMUNG
VON
P50
UND
P60
.
71
2.6
SOLUBILISIERUNG
DER
TRANSFERASEAKTIVITAETEN
.
71
2.6.1
EXTRAKTION
MIT
OCTYL-SS-GLUCOSID
.
71
2.6.2
EXTRAKTION
MIT
CHAPSO
.
7
2
2.6.3
TEMPERATURSTABILITAET
DER
SOLUBILISIERTEN
T
RANSFERASEAKTIVITAET.
7
4
2.6.4
PRAEPARATIVE
GELPERMEATION
DER
SOLUBILISIERTEN
TRANSFERASENAKTIVITAET
UEBER
EINE
SUPERDEX
200
SAEULE
.
75
3
DISKUSSION
.
76
4
MATERIAL
UND
METHODEN
.
86
4.1
GERAETE
.
86
4.2
CHEMIKALIEN,
PUFFER
UND
NAEHRBOEDEN
.
87
4.2.1
CHEMIKALIEN
.
87
4.2.2
PUFFER
.
87
4.2.3
NAEHRBOEDEN
.
8
8
4.3
BAKTERIEN
.
90
4.3.1
E.COLI
WILDSTAEMME
.
90
4.3.2
E
COLI
LABORSTAEMME
.
90
4.3.3
E.COLI
MUTANTEN
UND
PLASMIDE
.
91
4.3.4
AUFBEWAHRUNG
DER
BAKTERIEN
.
91
4.3.5
BAKTERIENZUECHTUNG
.
91
4.4
BAKTERIENDESINTEGRATION
.
92
4.4.1
BAKTERIENDESINTEGRATION
MIT
ULTRASCHALL
.
92
4.4.2
BAKTERIENDESINTEGRATION
MITTELS
FRENCH
PRESSURE-CELL
.
92
4.5
POLYSACCHARIDISOLIERUNGEN
.
93
4.5.1
ISOLIERUNG
DES
POLYSACCHARIDS
AUS
DER
KAPSEL
.
93
4.5.3
ISOLIERUNG
DES
POLYSACCHARIDS
AUS
DEM
ZYTOPLASMA
.
93
4.5.3
ISOLIERUNG
DES
POLYSACCHARIDS
AUS
DEM
PERIPLASMA
.
94
4.5.4
REINIGUNG
DES
KAPSELPOLYSACCHARIDS
MIT
DETOXI
TM-GEL
.
94
4.6
PRAEPARATION
ENZYMATISCH
AKTIVER
BAKTERIENMEMBRANEN
.
9
4
4.6.1
ISOLIERUNG
DER
MEMBRANEN
.
94
4.6.2
EXTRAKTION
DER
MEMBRANEN
MIT
OCTYL-SS
GLUCOSID
.
95
4.6.3
EXTRAKTION
DER
MEMBRANEN
MIT
CHAPSO
.
95
4.7
ISOLIERUNG
DES
ZYTOPLASMAS
.
95
4.8
ISOLIERUNG
DES
GLUTATHION-S-TRANSFERASE-P44
FUSIONSPROTEINS
.
95
4.9
CHARAKTERISIERUNG
DER
POLYSACCHARIDE
.
96
4.9.1
QUANTITATIVE
LIPIDBESTIMMUNG
.
96
4.9.2
MILDE
HYDROLYSE
ZUR
ABSPALTUNG
DER
PHOSPHATIDSAEURE
VOM
K5-POLYSACCHARID
.
9
6
4.9.3
REDUKTION
DES
REDUZIERENDEN
ZUCKERS
IM
POLYSACCHARID
.
96
4.9.4
METHANOLYSE
DES
K5-POLYSACCHARIDS
.
97
4.9.5
PERMETHYLIERUNG
DER
ZUCKER
.
97
4.9.6
REINIGUNG
DER
PERMETHYLIERTEN
ZUCKER
UEBER
EINE
SEP-PAKIA
KARTUSCHE
.
98
4.9.7
GASCHROMATOGRAPHIE/MASSENSPEKTROSKOPIE
.
9
8
4.9.8
PARTIELLE
HYDRAZINOLYSE
.
9
8
4.9.9
NITRITSPALTUNG
.
99
4.9.10
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
DES
POLYSACCHARIDS
.
99
4.9.11
ABSPALTUNG
DER
ENDSTAENDIGEN
4,5-UNGE
SAETTIGTEN
GLUCURONSAEURE
MIT
HGCIG
.
100
4.10
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
100
4.10.1
POLYMERASE-CHAIN-REACTION
(PCR)
.
100
4.10.2
REINIGUNG
DES
PCR-PRODUKTES
.
101
4.10.2.1
ISOLIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
AUS
DEM
AGAROSEGEL
.
101
4.10.2.2
REINIGUNG
DES
PCR
PRODUKTES
MIT
POLYETHYLENGLYCOL
(PEG)
.
101
4.10.3
PRAEPARATIONEN
VON
PLASMID-DNS
.
102
4.10.3.1
MINIPREP
.
102
4.10.3.2
MAXIPREP
.
102
4.10.3.3
CSCI-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
103
4.10.4
RESTRIKTIONSVERDAU
/DEPHOSPHORYLIERUNG
DES
VEKTORS
UND
LIGATION
.
103
4.10.4.1
SPALTEN
DER
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
1
03
4.10.4.2
PHOSPHATASEBEHANDLUNG
.
103
4.10.4.3
LIGATION
.
104
4.10.5
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNS
.
104
4.10.5.1
ELEKTROPORATION
.
104
4.10.5.2
CACL2-METHODE
.
105
4.11
QUANTITATIVE
BESTIMMUNGEN
.
105
4.11.1
BESTIMMUNG
DES
NUKLEINSAEUREGEHALTES
.
105
4.11.2
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTES
NACH
LOWRY,
FOLIN
UND
CIOCALTEU
.
106
4.11.3
BESTIMMUNG
DES
GLUCURONSAEUREGEHALTES
.
106
4.12
RADIOAKTIVE
BESTIMMUNGEN
.
107
4.12.1
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
.
107
4.12.2
IN
VITRO-LNKUBATIONSANSAETZE
.
107
4.12.3
FILTERTEST
.
108
4.12.4
ANALYSE
DES
UEBERSTANDES
DURCH
CHROMATO
GRAPHIE
AN
SEPHADEX
G-25
(PD10)
.
108
4.12.5
AUTORADIOGRAPHIE
.
109
4.13
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN.
.109
4.13.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS
PAGE)
.
109
4.13.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
111
4.13.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
114
4.14
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
115
4.14.1
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
115
4.15.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
116
4.15.2.1
GLUTATHION
SEPHAROSE
4B
.
116
4.15.2.2
REINIGUNG
EINES
SERUMS
UEBER
EINE
PROTEIN
A-SAEULE
.
116
4.15.2.3
ANTIKOERPERGEKOPPELTE
DIVINYLSULFONSAEURE
(DVS)-AGAROSE
.
117
4.15.3
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
117
4.16
BESTIMMUNG
DER
UDP-GLUCOSE
DEHYDROGENASE
AKTIVITAET
.
118
4.17
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
118
4.17.1
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
.
118
4.17.2
FESTPHASEN-ELISA
(ENZYME-LINKED
-IMMUNO
SORBENT-ASSAY)
.
119
4.17.3
WESTERN-BLOT-ANALYSE
.
1
21
4.17.3.1
TRANSFER
DER
PROTEINE
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
.
121
4.17.3.2
ENTWICKLUNG
DER
NITROZELLULOSE
MEMBRAN:
.
1
22
4.18
COMPUTERANALYSEN
VON
PEPTID
UND
DNS
SEQUENZEN
.
122
5
LITERATUR
.
123 |
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