Das Lectin aus Pleurotus ostreatus und seine Wechselwirkung mit einer endogenen Phosphatase:
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adam_text | DAS LECTIN AUS PLEUROTUS OSTREATUS UND SEINE WECHSELWIRKUNG MIT EINER
ENDOGENEN PHOSPHATASE DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES DER BAYERISCHEN JULIUS -
MAXIMILIANS - UNIVERSITAET WUERZBURG VORGELEGT VON FRITZ CONRAD AUS
SAARBRUECKEN WUERZBURG 1994 INHALTSVERZEICHNIS SEITE EINLEITUNG II.
ISOLIERUNG DES PLEUROTUS-OATREATUA-J JECTMS 11.1. HERSTELLUNG DES
ROHEXTRAKTES 5 11.2. BESTIMMUNG DER LECTINAKTIVITAET 5 11.3.
ELEKTROPHORESE UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 6 11.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE LECTINREINIGUNG 7 II.4.1.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN DEMU-SEPHAROSE 4B 9 11.4.1.1. KOPPLUNG VON
DEMU AN AKTIVIERTE SEPHAROSE 4B 10 11.4.1.2. CHROMATOGRAPHIE VON
PLEUROTUS OSTREATUS ROHEXTRAKT AN DEMU-SEPHAROSE 4B 12 11.4.1.3. ELUTION
UNTER MODIFIZIERTEN BEDINGUNGEN 14 H.4,2. ISOLIERUNGSVERSUCHE AN ANDEREN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIEMEDIEN 19 II.4.2.1. CHROMATOGRAPHIE AN SEPHADEX
G 50 19 H.4,2.2. CHROMATOGRAPHIE AN OVOMUCOID-SEPHAROSE 4B 19 II.4.2.3.
CHROMATOGRAPHIE AN CONA-SEPHAROSE 4B 20 11.5. ZUSAMMENFASSUNG DER
VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG 22 III. PHYSIKALISCH-CHEMISCHE UND BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG DES PLEUROTUS-OSTREATUS- LECTINS 24 III. 1.
AGGLUTINATIONSAKTIVITAET 24 III.1.1. TITERBESTIMMUNGEN UNTER
VERSCHIEDENEN BEDINGUNGEN 24 IH.1.2. THERMOSTABILITAET DES LECTINS 26
III.1.3. HEMMUNG DER AGGLUTINATION DES POL LECTINS DURCH MONO- UND
OLIGOSACCHARIDE 27 111.2. UV-SPEKTREN 30 111.3. MOLEKULARGEWICHT IN DER
SDS-ELEKTROPHORESE 32 111.4. BESTIMMUNG DER MOLAREN MASSE DES PLEUROTUS-
OSTREATUS-LECTINS MITTELS SE-HPLC 35 111.5. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
36 II 1.6. STABILITAET DES PLEUROTUS-OSTREATUS-LECTINA 39 111.7.
BESTIMMUNG DES ZUCKERANTEILS DES LECTINS NACH DUBOIS UND ECKHARDT 39
111.8. ZUCKERUNTERSUCHUNG DURCH HPLC 42 III .9.
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG 48 111.9.1. AMINOSAEUREANALYSE NACH DEM
PICO-TAG-VERFAHREN 49 111.9.2. BESTIMMUNG VON CYSTEIN UND CYSTIN ALS
CARBOXYMETHYLCYSTEIN 53 111.9.3. BESTIMMUNG DES CYSTEINS NACH ELLMAN 54
111.9.4. TRYPTOPHANBESTIMMUNG NACH BALESTRIERI ET AL. 57 111.9.5.
ERGEBNIS DER UNTERSUCHUNG DER AMINOSAEURE- ZUSAMMENSETZUNG 60 IIJ.9.6.
VERGLEICH DER AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG MIT DER ANDERER PROTEINE 61 IV.
WECHSELWIRKUNG DES PLEUROTUA-OATREATUA-LECTINA MIT EINER ENDOGENEN
PHOSPHATASE 65 IV.1. VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER PHOSPHATASE- AKTIVITAET
67 IV.2. REINIGUNG DER PHOSPHATASE 68 IV.2.1. CHROMATOGRAPHIE AN EINER
G-25 SAEULE 68 IV.2.2. CHROMATOGRAPHIE AN HYDROXYLAPATIT 69 IV.2.3.
ULTRAFILTRATION AN MEMBRANEN VERSCHIEDENER PORENGROESSE 71 IV.2.4.
CHROMATOGRAPHIE VON PARTIELL GEREINIGTEN PHOSPHATASEPRAEPARATEN AN EINER
GPC-FPLC SAEULE VOR UND NACH DER ULTRAFILTRATION 73 IV.3.
CHARAKTERISIERUNG DER PHOSPHATASE AUS PLEUROTUS OSTREATUS 76 IV.3.1.
ZUCKERBESTIMMUNG NACH DUBOIS ET AL. 76 IV.3.2. PH-OPTIMUM DES ENZYMS 76
IV.3.3. MICHAELIS-MENTEN KINETIK DER PHOSPHATASE 78 IV.4. WECHSELWIRKUNG
VON PARTIELL GEREINIGTEN PHOSPHATASE- PRAEPARATEN MIT
PLEUROTUS-OSTREATUS-HECTIN 81 IV.5. HEMMVERSUCHE MIT DER PHOSPHATASE UND
DEM PLEUROTUS-OSTREATUS-HECTIN 85 IV.6. CHARAKTERISIERUNG DER
PHOSPHATASE HINSICHTLICH EINES MOEGLICHEN NATUERLICHEN SUBSTRATES 87
IV.6.1. ENZYMKINETIK MIT ATP ALS PHOSPHATASESUBSTRAT 89 V. DISKUSSION 91
VI. ANHANG 93 VII. EXPERIMENTELLER TEIL 95 VII.L. VII.1.1. VII.1.2.
VII.2. VII.2.1. VII.2.2. VII.2.2.1. MATERIAL REAGENZIEN GERAETE METHODEN
PUFFER ROHEXTRAKTE HERSTELLUNG EINES ROHEXTRAKTES ZUR LECTINISOLIERUNG
95 95 96 99 99 99 99 VII.2.2.2. HERSTELLUNG EINES ROHEXTRAKTES ZU
PHOSPHATASEISOLIERUNG 99 VII.2.3. HERSTELLUNG VON GELEN ZUR
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 100 VH.2.3.1. HERSTELLUNG VON DEMU-SEPHAROSE
4B 100 VII.2.3.1.1. ENTFERNUNG DER SIALINSAEURE VON DEN ZUCKERBAEUMEN 100
VII.2.3.1.2. BROMCYANAKTIVIERUNG VON SEPHAROSE 4B NACH KOHN/WILCHEK 100
VII.2.3.1.3. DIFFERENZSPEKTROSKOPISCHE BESTIMMUNG DER GELBELADUNG NACH
SCHURZ/RUEDIGER 101 VII.2.4. ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN 102 VII.2.4.1.
SDS-ELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI 102 VII.2.4.1.1. DOKUMENTATION DER
SDS-ELEKTROPHORESEGELE MITTELS PHOTOGRAPHIE 105 VII.2.4.2.
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 105 VII.2.5. CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN
106 VII.2.5.1. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 106 VII.2.5.2. GELFILTRATION
107 VII.2.5.3. CHROMATOGRAPHIE AN HYDROXYLAPATIT 107 VII.2.5.4.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 107 VII.2.5.5.
HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE HPLC 108 VII.2.5.5.1.
AMINOSAEUREANALYSE VON PROTEINEN 108 VII.2.5.5.2. BESTIMMUNG DER
PMP-ZUCKER NACH HONDA ET AL. (1989) 110 VII.2.6. BESTIMMUNG DER
PHOSPHATASEAKTIVITAET 111 VII.2.7. BESTIMMUNG DER LECTINAKTIVITAET 112
VII.2.8. VERFAHREN ZUR PROTEINBESTIMMUNG 113 VII.2.8.1.
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE PROTEINBESTIMMUNG 113 VII.2.8.2.
PROTEINBESTIMMUNG MIT BCA NACH SMITH ET AL. 113 ABBILDUNGSVERZEICHNIS
114 TABELLENVERZEICHNIS 119 LITERATURVERZEICHNIS 122
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