Poly(L-Malat) in Plasmodien von Physarum polycephalum: Untersuchungen zur Struktur, Funktion und Biosynthese
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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| adam_text | 3 POLY(L-MALAT) IN PLASMODIEN VON PHYSARUM POLYCEPHALUM: UNTERSUCHUNGEN
ZUR STRUKTUR, FUNKTION UND BIOSYNTHESE DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN
- DER UNIVERSITAET REGENSBURG VORGELEGT VON CHRISTINA WINDISCH AUS
ETZENRICBT 1994 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS SEITE 1.
EINLEITUNG 1 1.1. POLY(L-MALAT) - PMA 1 1.1.1. ALLGEMEINES 1 1.1.2.
STRUKTUR UND CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON POLY(L-MALAT) 3 1.1.3.
BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON POLY(L-MALAT) 3 1.1.4. KOMPARTIMENTIERUNG
VON POLY(L-MALAT) 4 1.2. EUKARYONTISCHE KERNPROTEINE MIT POLYANIONISCHEN
DOMAENEN 4 1.3. POLY(SS-HYDROXYALKANOATE) - EINE MIT PMA VERWANDTE
SUBSTANZ- KLASSE 7 1.3.1. STRUKTUR VON POLY(SS-HYDROXYALKANOATEN) . . 7
1.3.2. VERBREITUNG UND FUNKTION LANGKETTIGER POLY(SS-HYDROXYALKANOATE) 7
1.3.3. VERBREITUNG UND FUNKTION KURZKETTIGER POLY(SS-HYDROXY-
BUTTERSAEUREN) 8 1.3.4. ENZYMOLOGIE DER
POLY(SS-HYDROXYBUTTERSAEURE)-SYNTHESE ? 9 1.3.5. POSTULIERTER
REAKTIONSMECHANISMUS DER PHA-SYNTHASE 11 1.4. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 13
2. MATERIALIEN 14 2.1. CHEMIKALIEN UND ENZYME; GERAETE 14 2.1.1.
CHEMIKALIEN UND ENZYME 14 2.1.2 GERAETE 15 2.2. ORGANISMEN UND PLASMIDE
16 2.3. MEDIEN . 16 2.3.1. KULTURMEDIUM FUER PHYSARUM POLYCEPHALUM 16
2.3.2. BAKTERIEN-MEDIEN 17 2.4. PUFFER UND LOESUNGEN 18 3. METHODEN 23
3.1. BIOCHEMISCHE METHODEN 23 3.1.1. ANZUCHT VON MIKROPLASMODIEN VON
PHYSARUM POLYCEPHALUM 23 INHALTSVERZEICHNIS II 3.1.2. ERNTE VON
MIKROPLASMODIEN 23 3.1.3. ANZUCHT VON MAKROPLASMODIEN 23 3.1.3.1.
ANZUCHT AUF FLIISSIGMEDIUM UND FILTERPAPIER 23 3.1.3.2. ANZUCHT AUF
AGARPLATTEN 24 3.1.4. BESTIMMUNG DES MITOSEZEITPUNKTS VON
MAKROPLASMODIEN 24 3.1.5. INJEKTION VON MAKROPLASMODIEN 25 3.1.6. ERNTE
VON MAKROPLASMODIEN 25 3.1.7. ZELLAUFSCHLUESSE 26 3.1.7.1. HERSTELLUNG
EINES ROHEXTRAKTES FUER IN V/FRO-MARKIERANGEN 26 3.1.7.2. HERSTELLUNG
EINES ROHEXTRAKTES NACH IN VIVO-MARKIERUNGEN 26 3.1.8.
CHROMATOGRAPHISCHE AUFTRENNUNG VON POLY(L-MALAT) UND SEINEN OLIGOMEREN
26 3.1.8.1. AUFTRENNUNG UEBER HOCHDRUCKSFLUESSIGKEITS-CHROMATOGRAPHIE
(HPLC) 26 3.1.8.2. AUFTRENNUNG UEBER IONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE AN
DEAE- SEPHACEL 28 3.1.9. QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON L-MALAT 29 3.1.10.
DNA-POLYMERASE A - HEMMTEST FUER POLY(L-MALAT) UND ANDERE POLYANIONEN .-.
30 3.1.11. NACHWEIS VON SH-GRUPPEN 31 3.1.12. DARSTELLUNG VON
SUCCINYL-COA 31 3.1.13. DARSTELLUNG VON MALYL-COA 32 3.1.14.
QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD (1976) 32 3.2. GENETISCHE
ARBEITSMETHODEN 33 3.2.1. ANZUCHT VON BAKTERIEN 33 3.2.2. TRANSFORMATION
VON ESCHERICHIA COLI 33 3.2.3. PLASMID-DNA-MINIPRAEPARATION 34 3.2.4.
BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN 34 3.2.4.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN DURCH MESSUNG DER
ABSORPTION BEI 260 NM 34 3.2.4.2. DNA-BESTIMMUNG MIT DIAMINOBENZOESAEURE
35 3.2.4.3. DNA-TUEPFELTEST 36 3.2.5. RESTRIKTIONSYERDAU VON DNA 36
3.2.6. FAELLUNG VON DNA 36 3.2.7. POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) ; 37
3.2.8. DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN MIT QIAEX 37 3.2.9. KLONIERUNG
VON DNA 37 INHALTSVERZEICHNIS 3.2.9.1. HERSTELLUNG VON DNA MIT GLATTEN
ENDEN DURCH INKUBATION MIT T4- DNA-POLYMERASE 38 3.2.9.2
DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 38
3.2.9.3. PHOSPHORYLIERUNG VON DNA MIT 5 -OH-ENDEN 38 3.2.9.4. LIGIERUNG
VON DNA-FRAGMENTEN 39 3.2.10. GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 39
3.2.10.1. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 39 3.2.10.2. SEQUENZGELE : 39 3.2.11.
AUTORADIOGRAPHIE 40 3.2.12. SEQUENZIERUNG VON DNA 40 4. ERGEBNISSE 42
4.1. STRUKTUR-FUNKTIONSBEZIEHUNG VON POLY(L-MALAT) 42 4.1.1. EINFUEHRUNG
42 4.1.2. INHIBITION VON DNA-POLYMERASE A DURCH POLY(L-MALAT) UND
VERWANDTE POLYANIONEN 42 4.1.3. COMPUTERGESTUETZTE STRUKTURANALYSE VON
POLY(L-MALAT) UND VERWANDTEN POLYANIONEN 44 4.1.3.1. VORBEMERKUNG 44
4.1.3.2. STRUKTURANALYSE VON POLY(L-MALAT) 44 4.1.3.3.
ENERGIEMINIMIERUNG ZUR BERECHNUNG DER LADUNGSABSTAENDE VON POLY(L-MALAT)
UND VERWANDTEN POLYANIONEN 45 4.1.4. KORRELATION ZWISCHEN HEMMWIRKUNG
UND STRUKTUR DER UNTERSUCHTEN POLYANIONEN 46 4.1.5. IN
VIVO-UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON POLY(L-MALAT) IM ZELLZYKLUS 47
4.1.5.1. EINFUEHRUNG 47 4.1.5.2. WIRKUNG VON POLY(L-MALAT) AUF DEN
ZELLZYKLUS 48 4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR BIOSYNTHESE VON POLY(L-MALAT) 50
4.2.1. BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR SYNTHESE VON POLY(L-MALAT) 50
4.2.1.1. EINFUEHRUNG 50 4.2.1.2. PRECURSORSTUDIEN AN ZELLEXTRAKTEN.
ANALYSE MIT HILFE VON HPLC 51 4.2.1.2.1. AUFTRENNUNG VON POLY(L-MALAT)
UND SEINEN OLIGOMEREN MIT HILFE VONRP-HPLC 51 4.2.1.2.2. CHEMISCHE
AKTIVIERUNG VON L-MALAT 53 INHALTSVERZEICHNIS IV 4.2.1.2.2.1.
ARBEITSHYPOTHESE 53 4.2.1.2.2.2. AKTIVIERUNG VON L-MALAT DURCH ATP UND
COENZYM A 53 4.2.1.2.2.3. AKTIVIERUNG VON L-MALAT MIT
SUCCINAT-THIOKINASE.. 55 4.2.1.2.2.4. AKTIVIERUNG VON L-MALAT UEBER
SUCCINYL-COA MIT ENDOGENER COA- TRANSFERASE 56 4.2.1.3. OPTIMIERUNG DES
KULTURMEDIUMS BEZUEGLICH DER POLY(L-MALAT)- SYNTHESE ; 57 4.2.1.3.1.
EINFUEHRUNG 57 4.2.1.3.2. KORRELATION ZWISCHEN GLUKOSEKONZENTRATION,
WACHSTUM UND PMA- SYNTHESE 58 4.2.1.3.3. ZUSATZ VON L-MALAT ZU
STANDARDMEDIUM MIT REDUZIERTEM GLUKOSEGEHALT 59 4.2.1.4.
BIOSYNTHESESTUDIEN MIT ANSCHLIESSENDER ANALYSE DURCH CHROMATOGRAPHIE AN
DEAE-SEPHACEL 61 4.2.1.4.1. EINFUEHRUNG . 61 4.2.1.4.2. QUANTITATIVE
AUFREINIGUNG VON POLY(L-MALAT) DURCH CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-SEPHACEL 61
4.2.1.4.3. BIOSYNTHESE VON POLY(L-MALAT) AUS [ 14 C]-GLUKOSE 63
4.2.1.4.3.1. LANGZEITMARKIERUNG VON MIKROPLASMODIEN 63 4.2.1.4.3.2.
BIOSYNTHESE VON POLY(L-MALAT) IM ZELLZYKLUS 64 4.2.1.4.3.2.1.
QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER POLY(L-MALAT)-SYNTHESE IM ZELLZYKLUS 64
4.2.1.4.3.2.2. QUALITATIVE BESTIMMUNG DER POLY(L-MALAT)-SYNTHESE IM
ZELLZYKLUS 64 4.2.1.4.4. BIOSYNTHESE VON POLY(L-MALAT) AUS L-MALAT UND
SUCCINAT 65 4.2.1.4.4.1. EINFUEHRUNG 7. 65 4.2.1.4.4.2. IN
VIVO-UNTERSUCHUNGEN MIT [ 14 C]-L-MALAT 66 4.2.1.4.4.3. IN
VI TRO-UNTERSUCHUNGEN MIT [ 14 C]-MALYL-COA 66 4.2.1.4.4.4. IN
VIVO-UNTERSUCHUNGEN MIT [ 14 C]-SUCCINAT 67 4.2.1.4.4.5. IN
VIFRO-UNTERSUCHUNGEN MIT [ 14 C]-SUCCINYL-COA 69 4.2.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER HOMOLOGIE ZWISCHEN PMA-SYNTHASE
UND PHA-SYNTHASEN 71 4.2.2.1. ARBEITSHYPOTHESE 71 4.2.2.2. PCR MIT EINEM
PHAC-GENSPEZIFISCHEN PRIMER 71 4.2.2.3. KLONIERUNG DER PCR-FRAGMENTE 74
4.2.2.4. SEQUENZANALYSE DER PCR-FRAGMENTE 74 4.2.2.5. PCR MIT ZWEI
PHAC-GENSPEZIFISCHEN PRIMERN 81 4.2.2.6. SEQUENZANALYSE DER FRAGMENTE
DER 2. PCR 83 INHALTSVERZEICHNIS 5. DISKUSSION 85 5.1. MOEGLICHE
FUNKTIONEN VON POLY(L-MALAT) 85 5.1.1. MOEGLICHE FUNKTION VON
SEZERNIERTEM, EXTRAZELLULAEREM POLY(L-MALAT) 86 5.1.2. MOEGLICHE FUNKTION
VON INTRAZELLULAEREM POLY(L-MALAT) 87 5.2. MODELLE ZUR BIOSYNTHESE VON
POLY(L-MALAT) 91 5.3. HOMOLOGIESTUDIEN ZWISCHEN PHA- UND PMA-SYNTHASEN
97 6. ZUSAMMENFASSUNG.. . 100 7. LITERATURVERZEICHNIS 102 8. ANHANG 110
8.1. DNA-ORIGINALSEQUENZEN DER DURCH PCR AMPLIFIZIERTEN FRAGMENTE 110
8.1.1. DNA-SEQUENZEN DER PCR-FRAGMENTE AUS KAPITEL 4.2.2.2 110 8.1.2.
DNA-SEQUENZEN DER PCR-FRAGMENTE AUS KAPITEL 4.2.2.5 114
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