Wechselwirkungen zwischen Transfers-RNAs und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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ABKUERZUNGEN
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
ERKENNUNG
UND
IDENTITAET
3
2.
PROBLEMSTELLUNG
6
3.
MATERIAL
3.1.
GERAETE
7
3.2.
VERBRAUCHSMARTERIAL
7
3.3.
CHEMIKALIEN
7
3.4.
RADIOCHEMIKALIEN
9
3.5.
ENZYME
9
3.6.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
10
3.7.
STOCKLOESUNGEN
10
4.
METHODEN
4.1.
SYNTHESEN
4.1.1.
3
'-O-ACETYL-2
'-FLUORO-2
'-DESOXYURIDIN
13
4.1.2.
2
'-FLUORO-2
'DESOXYURIDIN-5
'-A-THIOTRIPHOSPHAT
13
4.2.
ALLGEMEINE
METHODEN:
DNA
UND
RNA
4.2.1.
REINIGUNG
MIT
SEP-PAK-KARTUSCHEN
17
4.2.2.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
17
4.2.3.
ELUTION
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
"FREEZE
SQUEECE"
18
4.2.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
18
4.2.5.
RUECKGEWINNUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
19
4.2.6.
PHENOLEXTRAKTION
20
4.2.7.
PRAEZIPITATION
VON
DNA
UND
RNA
20
4.2.8.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
20
4.2.9.
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
UND
TRENNUNGVON
DIASTEREOMERE
AM
HPLC
21
4.2.10.
SYNTHESE
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
UND
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
21
4.3.
METHODEN:
DNA
4.3.1.
AUFREINIGUNG
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
DURCH
HPLC
22
4.3.2.
5
'-END-PHOSPHORYLIERUNG
22
4.3.3.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
23
4.3.4.
LIGATION
23
4.3.5.
TRANSFORMATION
IN
E.
COZT-ZELLEN
4.3.5.1.
ERSTELLUNG
DER
NAEHRMEDIEN
23
4.3.5.2.
STAMMHALTUNG
25
4.3.5.3.
DARSTELLUNG
VON
KOMPETENTE
ZELLEN
25
4.3.5.4.
TRANSFORMATION
25
4.3.6.
PRAEPARATION
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
4.3.6.1.
ZELLENANZUCHT
26
4.3.6.2.
ISOLIERUNGVON
PLASMID-DNA
NACH
QIAGEN
26
4.3.7.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTAENGIGER
DNA
27
4.3.8.
IN
VITRO
"RUN
OFF'
TRANSKRIPTION
27
4.4.
METHODEN:
RNA
4.4.1.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
IN
VITRO
TRANSKRIPTEN
28
4.4.2.
AUFREINIGUNG
VON
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
28
4.4.3.
5
'-PHOSPHORYLIERUNG
4.4.3.I.
ENDMARKIERUNG
MIT
PY^PJ-ATP
29
4.4.3.2.
5
'-PHOSPHORYLIERUNG
MIT
ATP
30
4.4.4.
AMINOACYLIERUNG
30
4.4.5.
JODSPALTUNG
VON
PHOSPHOROTHIOAT-TRANSKRIPTEN
4.4.5.I.
SEQUENZIERUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
31
4.4.5.2.
SEQUENZIERUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
32
4.4.6.
FOOTPRINTING
32
4.4.7.
TRENNUNG
AMINOACYLIERTER
VON
NICHT
AMINOACYLIERTER
TRNA
4.4.7.1.
DERIVATISIERUNG
AMINOACYLIERTER
TRNA
33
4.4.7.2.
TRENNUNG
DURCH
EIN
AFFINITAETSGEL
33
4.4.8.
LIGATION
VON
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
ZUR
E.
COLI
TRNAAESP
34
5.
ERGEBNISSE
5.1.
FOOTPRINTINGUNTERSUCHUNGEN
MIT
E.
COLI
TRNAASP
5.1.1.
DARSTELLUNG
DER
IN
VITRO
TRANSKRIPTE
MIT
DER
PLASMID-DNA
ASPUC19W.T.
35
5.1.2.
AMINOACYLIERUNG
VON
2'-HYDROXYL-PHOSPHOROTHIOATHALTIGEN
IN
VITRO
TRANSKRIPTEN
38
5.1.3.
SPALTUNG
DER
PHOSPHOROTHIOAT-TRANSKRIPTEN
40
5.1.4.
FOOTPRINTING
DES
E.
COLI
TRNAASP
/
E.
COLI
ASPRS
KOMPLEXES
44
5.1.5.
FOOTPRINTING
DES
E.
COLI
TRNAASP
/
HEFE
ASPRS
KOMPLEXES
50
5.2.
UNTERSUCHUNG
ZUR
BEDEUTSAMKEIT
DER
2
'-HYDROXYLGRUPPE
DES
URIDINS
BEI
DER
AMINOACYLIERUNG
IN
DER
E.
COLI
TRNAASP
5^2.1.
UNTERSUCHUNGEN
MIT
IN
VITRO
TRANSKRIPTEN
55
5.2.2.
LIGATION
VON
OLIGORIBONUKLEOTIDEN
ZUR
E.
COLI
TRNAASP
UND
IHRE
AMINOACYLIERUNG
60
5.3.
KLONIERUNG
DES
E.
COLI
TRNA
ASN
-GENS
IN
EINEN
VEKTOR
PUC19
64
6.
DISSKUSSION
71
6.1.
FOOTPRINTING-EXPERIMENTE
IM
KOMPLEX
74
6.2.
TRENNUNG
VON
AMINOACYLIERTER
UND
NICHT
AMINOACYLIERTER
E.
COLI
TRNAASP
UND
IDENTIFIKATION
DER
2
'-HYDROXYLGRUPPEN
79
7.
ZUSAMMENFASSUNG
82
8.
REFERENZEN
83 |
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