Regulation der Transkription des E1A-Onkogens von Adenovirus Serotyp 12:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Essen, Univ., Diss., 1994 |
| Beschreibung: | 145 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
DNA-TUMORVIREN
1
1.2
ADENOVIREN
1
1.2.1
DIEELA-REGION
3
1.2.1.1
VIRUS-ZELL-INTERAKTION
6
1.2.1.2
TRANSKRIPTIONSREGULATION
VON
EIA
7
1.3
PROBLEMSTELLUNG
10
2
MATERIALIEN
11
2.1
ZELLINIEN
11
2.2
VIREN
11
2.3
BAKTERIEN
12
2.4
PLASMIDE
12
2.5
DNA-FRAGMENTE
UND
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
GEL-RETARDATIONS
14
ANALYSEN
2.6
DNA-FRAGMENTE
FUER
DIE
HERSTELLUNG
DER
PCAT-KONSTRUKTE
17
2.7
PRIMER
UND
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
HERSTELLUNG
DER
DNA
18
FRAGMENTE
DER
PCAT-KONSTRUKTE
UND
PRIMER
NLR
DIE
SEQUENZIERUNG
2.8
ANTIKOERPER
20
2.9
MEDIEN
UND
SEREN
21
2.10
LOESUNGEN
22
2.11
ENZYME,
NUKLEINSAEUREN,
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
UND
KITS
30
2.12
CHEMIKALIEN
31
2.13
VERBRAUCHSMATERIALIEN
32
2.14
GERAETE
32
2.15
RADIOAKTIVE
MATERIALIEN
33
3
METHODEN
34
3.1
ZELLKULTUR
34
3.1.1
VIRUS
VERMEHRUNG
UND
VIRUSISOLIERUNG
35
3.1.2
VIRUSINFEKTION
35
3.2
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
36
3.2.1
FAELLEN
VON
NUKLEINSAEUREN
36
3.2.2
PHENOLEXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEURELOESUNGEN
36
3.2.3
REINIGUNG
VON
DNA
UEBER
GELCHROMATOGRAPHIE
36
3.2.3.1
GELCHROMATOGRAPHIE
UEBER
ZENTRIFUGATIONSSAEULEN
36
3.2.3.2
GELCHROMATOGRAPHIE
UEBER
SEPHADEXG25-FERTIGSAEULEN
37
3.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-UND
POLYACRYLAMIDGELEN
37
3.2.4.1
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
NIEDRIG-SCHMELZENDER
37
AGAROSE
(SEAPLAQUEGTG)
MIT
PHENOL
3.2.4.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
NIEDRIG-SCHMELZENDER
38
AGAROSE
(SEAPLAQUEGTG)
UEBER
EINEN
ANIONENAUSTAUSCHER
DER
FIRMA
DIAGEN
3.2.4.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
NIEDRIG-SCHMELZENDER
38
AGAROSE
(SEAPLAQUEGTG)
UEBER
GENECLEAN
3.2.4.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
NUSIEVEGTG-AGAROSE
DURCH
38
ELEKTROELUTION
3.2.4.5
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
39
3.2.5
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
39
3.2.5.1
ENTSCHUETZEN
UND
ABSPALTEN
DES
OLIGONUKLEOTIDS
VON
DER
MATRIX
39
3.2.5.2
HERSTELLUNG
DOPPELSTRAENGIGER
OLIGONUKLEOTIDE
40
3.2.5.3
REINIGUNG
EINZELSTRAENGIGER
OLIGONUKLEOTIDE
DURCH
POLY-PAK
RP
1
40
KARTUSCHEN
3.2.5.4
REINIGUNG
EINZELSTRAENGIGER
OLIGONUKLEOTIDE
DURCH
POLYACRYLAMID
40
GELELEKTROPHORESE
3.2.6
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
41
3.2.6.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIMBOIM
UND
DOLY
41
3.2.6.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
UEBER
EINEN
ANIONENAUSTAUSCHER
DER
42
FIRMA
DIAGEN
3.2.6.3
PLASMIDPRAEPARATION
IN
KLEINEM
MASSSTAB
("MINIPRAEPARATION")
42
3.2.7
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
VIRUSPARTIKELN
43
3.2.8
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
43
3.2.8.1
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
DURCH
PROTEINASE
K-VERDAU
43
3.2.8.2
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
UEBER
QIAGEN-MINISAEULEN
44
(QIAQUICK-SPIN)
3.3
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
44
3.3.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
44
3.3.1.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
44
3.3.1.2
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
DURCH
VERGLEICH
MIT
45
REFERENZPROBEN
3.3.1.3
TUEPFELTEST
AUF
AGAROSE
45
3.3.2
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
45
3.3.2.1
HORIZONTALELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
AGAROSE
45
3.3.2.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
46
3.3.2.2.1
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
46
3.3.2.2.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESEUNTERDENATURIERENDEN
47
BEDINGUNGEN
3.3.2.2.3
DETEKTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
ETHIDIUMBROMID-FAERBUNG
47
3.3.2.2.4
DETEKTION
UEBER
FLUORESZENZ-ABSORPTION
48
3.3.2.2.5
SILBERFAERBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
48
3.3.2.2.6
SEQUENZGELE
48
3.3.2.3
BESTIMMUNG
DER
GROESSE
VON
NUKLEINSAEUREFRAGMENTEN
DURCH
49
VERGLEICH
MIT
MARKERBANDEN
3.3.3
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
50
3.4
KLONIERUNG
VON
DNA
51
3.4.1
SCHNEIDEN
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
51
3.4.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
VEKTOR-DNA
52
3.4.3
AUFFILLLEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DEM
KLENOW-FRAGMENT
DER
52
E.COLI
DNA-POLYMERASE
3.4.4
LIGATION
52
3.4.4.1
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
UEBERHAENGENDEN
ENDEN
53
3.4.4.2
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
OHNE
UEBERHAENGENDE
ENDEN
(BLUNT
53
END)
3.4.4.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
NIEDRIG-SCHMELZENDER
AGAROSE
54
3.5
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
54
3.5.1
3
'ENDMARKIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGEN
DNA-FRAGMENTE
54
3.5.2
MARKIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGEN
DNA-FRAGMENTEN
55
3.6
AMPLIFIZIEREN
VON
DNA
DURCH
PCR
56
3.6.1
AMPLIFIZIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
NEU
EINGEFUEHRTEN
56
RESTRIKTIONSENZYMERKENNUNGSSTELLEN
3.6.2
AMPLIFIZIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
PUNKTMUTATIONEN
57
3.7
TRANSFEKTION
KOMPETENTER
ECO/I-ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
59
3.7.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ECO/I-ZELLEN
59
3.7.2
TRANSFEKTION
KOMPETENTER
E.COZI-ZELLEN
60
3.7.3
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
KLONE
61
3.7.3.1
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
KLONE
DURCH
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
61
3.8
PRAEPARATION
VON
KEMEXTRAKTEN
AUS
SAEUGERZELLEN
62
3.9
ANALYSE
VON
E
1
A-PROMOTER-BINDENDEN
PROTEINEN
64
3.9.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
64
3.9.1.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
DURCH
64
MESSUNG
DER
ABSORPTION
IM
UV
3.9.1.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
64
3.9.2
GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
65
3.9.2.1
SDS-POLY
ACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
65
3.9.2.2
DETEKTION
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
65
3.9.2.2.1
SILBERFAERBUNG
66
3.9.2.2.2
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
R250
66
3.9.2.3
BESTIMMUNG
DER
MOLMASSE
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMID
66
GELEN
DURCH
VERGLEICH
MIT
MARKERBANDEN
3.9.2.4
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA-PROTEIN-KOMPLEXEN
67
3.9.3
ANALYSE
VON
DNA-BINDENDEN
PROTEINEN
DURCH
GEL-RETARDATIONS
68
ANALYSEN
3.9.3.1
ISOLIERUNG
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
UND
DNA-FRAGMENTE
68
3.9.3.2
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
DNA-FRAGMENTE
UND
68
OLIGONULDEOTIDE
3.9.3.3
KOMPETITIONSEXPERIMENTE,
SUPERSHIFT-/DISPLACEMENT-EXPERIMENTE,
69
VERDRAENGUNGS
UND
DISSOZIATIONSEXPERIMENTE
3.9.3.4
BINDUNGSEXPERIMENTE
MIT
DESOXYCHOLAT
(DOC)
70
3.9.3.5
LASER-DENSITOMETER-ANALYSE
VON
KOMPETITIONSEXPERIMENTEN
70
3.9.4
ANALYSE
VON
DNA-BINDENDEN
PROTEINEN
DURCH
SOUTH-WESTEM-BLOT
70
3.10
EINENGEN
VON
PROTEIN
UND
NUKLEINSAEURELOESUNGEN
DURCH
71
ULTRAFILTRATION
3.11
UNTERSUCHUNG
TRANSKRIPTIONSREGULIERENDER
DNA-SEQUENZEN
71
3.11.1
HERSTELLUNG
DER
PCATADL2ELA-KONSTRUKTEEATE,
ATE,
EXT,
71
XTE,
TE
UND
T
3.11.2
TRANSFEKTION
VON
HELA-,
293
UND
A549-ZELLEN
73
3.11.3
PRAEPARATION
VON
ZELLEXTRAKTEN
73
3.11.4
BESTIMMUNG
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYL-TRANSFERASE
(CAT)
73
AKTIVITAET
IN
ZELLEXTRAKTEN
3.12
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
ELA-PROTEINE
74
PQE8-ADL2WT
EL
A-12S
UND
PQE8-ADL2WTELA-13S
3.12.1
EXPRESSION
GROESSERER
MENGEN
DER
FUSIONSPROTEINE
74
3.12.2
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
AUS
BAKTERIENLYSATEN
DURCH
.
75
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UEBER
NI2+-NTA-AGAROSE
3.12.3
RENATURIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
EL
A-PROTEINE
75
4
ERGEBNISSE
76
4.1
CHARAKTERISIERUNG
EIA-PROMOTER
BINDENDER
PROTEINE
DURCH
76
GEL-RETARDATIONS-ANALYSEN
4.1.1
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
DAS
DNA-FRAGMENT
ADL2ELA-185
76
UND
KOMPETITIONSEXPERIMENTE
MIT
DEM
DNA-FRAGMENT
SELBST
UND
VERSCHIEDENEN
OLIGONUKLEOTIDEN
4.1.2
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
DAS
AD
12ELA-E2F(A)
79
OLIGONUKLEOTID
UND
BEEINFLUSSUNG
DURCH
KOMPETITOR
OLIGONUKLEOTIDE
UND
ANTIKOERPER
4.1.3
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
DIE
OLIGONUKLEOTIDE
ADL2EL
A
92
ATF-I
UND
ATF-H:
EINFLUSS
VON
KOMPETITOR-OLIGONUKLEOTIDEN
UND
ANTIKOERPERN
4.1.4
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
DAS
ADL2EL
A-E2F(B)
95
OLIGONUKLEOTID
UND
EINFLUSS
VON
ANTIKOERPERN
4.1.5
EINFLUSS
VON
DESOXYCHOLAT
(DOC)
AUF
DIE
BINDUNG
VON
97
KEMPROTEINEN
AN
DAS
E2F(A)-OLIGONUKLEOTID
4.1.6
EINFLUSS
VON
EL
A-PROTEINEN
AUF
DIE
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AN
98
DAS
E2F(A)-OLIGONUKLEOTID
4.1.6.1
EINFLUSS
REKOMBINANTER
ELA-PROTEINE
IN
VITRO
98
4.1.6.1.1
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
EIA-PROTEINE
PQE8
98
ADL2WTEL
A-12S
UND
PQE8-ADL2WTELA-13S
4.1.6.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
ADL2WTELA-12S
UND
100
ADL2WTELA-13S
IN
GEL-RETARDATIONS-ANALYSEN
4.1.6.2
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AUS
ADL2-UND
AD5-INFIZIERTEN
100
ZELLEN
AN
DAS
E2F(A)-OLIGONUKLEOTID
4.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
E2F(A)-OL
BINDENDEN
PROTEINEN
DURCH
101
SOUTH-WESTEM-BLOT-ANALYSEN
4.3
BEDEUTUNG
DER
E2F-MOTIVE
UND
DES
ATF/CREB-MOTIVS
AUS
103
DEM
ADL2ELA-PROMOTER
FUER
SEINE
TRANSKRIPTIONSREGULATION
VOM
TS
1
4.3.1
EINFLUSS
DER
ADL2ELA-KONSTRUKTE
AUF
DIE
CAT-AKTIVITAET
NACH
104
TRANSFEKTION
IN
HELA-,
293
UND
A549-ZELLEN
4.3.2
EINFLUSS
DES
1
3S
AD
1
2E
1
A-CDNA-EXPRESSIONSVEKTORS
PRC/RSV
108
AUF
DIE
CAT-AKTIVITAET
DER
ADL2EL
A-KONSTRUKTE
IN
HELA
UND
A549-ZELLEN
5
DISKUSSION
111
5.1
NACHWEIS
VON
E
1
A-BINDENDEN
PROTEINEN
111
5.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
E
1
A-BINDENDEN
PROTEINEN
115
5.3
BEDEUTUNG
DER
E2F-MOTIVE
UND
DES
ATF/CREB-MOTIVS
AUS
DEM
120
ADL2EL
A-PROMOTER
FUER
SEINE
TRANSKRIPTIONSREGULATION
VOM
TS
1
5.4
AUSBLICK
123
6
ZUSAMMENFASSUNG
123
7
ABKUERZUNGEN
125
8
LITERATUR
128
DANKSAGUNG
145
LEBENSLAUF |
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