Funktionelle und strukturelle Eigenschaften der Anionencarrier der inneren Mitochondrienmembran: Untersuchungen am Aspartat/Glutamat-Carrier und Phosphatcarrier im rekonstituierten System:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
ALLGEMEINE
EINLEITUNG
1.1
FUNKTION
UND
AUFBAU
DER
MITOCHONDRIEN
1
1.2
DIE
CARRIER
DER
INNEREN
MITOCHONDRIENMEMBRAN
2
1.3
DIE
STRUKTURFAMILIE
DER
CARRIER
DER
INNEREN
MITOCHONDRIENMEMBRAN
3
1.4
FUNKTIONELLE
ASPEKTE
DER
TRANSPORTKATALYSE
6
1.5
PORENARTIGE
EIGENSCHAFTEN
MITOCHONDRIALER
CARRIERPROTEINE
9
1.6
ZIELSETZUNG
DER
DURCHGEFUEHRTEN
STUDIEN
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
2.1
MATERIAL
13
2.2
PRAEPARATIVE
METHODEN
14
2.2.1
PRAEPARATION
DER
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
14
2.2.2
ANZUCHT
UND
PRAEPARATION
DER
HEFEMITOCHONDRIEN
14
2.2.3
PRAEPARATION
DES
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
AUS
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
15
2.2.4
PRAEPARATION
DES
PHOSPHATCARRIERS
AUS
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
15
2.2.5
PRAEPARATION
DES
PHOSPHATCARRIERS
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
16
2.2.6
FUNKTIONELLE
REKONSTITUTION
DES
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
17
2.2.7
FUNKTIONELLE
REKONSTITUTION
DES
PHOSPHATCARRIERS
AUS
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
17
2.2.8
FUNKTIONELLE
REKONSTITUTION
DES
PHOSPHATCARRIERS
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
18
2.3
ANALYTISCHE
METHODEN
19
2.3.1
BESTIMMUNG
DER
TRANSPORTAKTIVITAETEN
19
2.3.1.1
DIE
VORTAUSCHTECHNIK
19
2.3.1.2
DIE
RUECKTAUSCHTECHNIK
20
2.3.2
EFFLUXEXPERIMENTE
21
2.3.3
BESTIMMUNG
DES
AKTIVEN
INNENVOLUMENS
DER
PROTEOLIPOSOMEN
22
2.3.4
TRANSFORMATION
DER
APPARENTEN
TRANSPORTRATEN
22
2.4
ALLGEMEINE
METHODEN
23
2.4.1
SPEKTRALE
BESTIMMUNGEN
23
2.4.2
EINSTELLEN
DES
INTERNEN/EXTERNEN
PH-WERTES
23
2.4.3
EINSTELLEN
DER
KALIUMDIFFUSIONSPOTENTIALE
24
2.4.4
CHEMISCHE
MODIFIKATION
(INAKTIVIERUNG)
DER
CARRIERPROTEINE
24
2.4.5
UEBERPRUEFUNG
DES
SUBSTRATEINFLUSSES
AUF
DIE
INHIBITORWIRKUNG
25
2.4.6
UEBERPRUEFUNG
DER
GEGENSEITIGEN
BEEINFLUSSUNG
VERSCHIEDENER
REAGENZIEN
25
2.4.7
MODIFIZIERUNG
DER
CARRIERPROTEINE
DURCH
EINSATZ
[
14
C]-MARKIERTER
INHIBITOREN
25
2.4.8
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
DES
[
14
C]-MARKIERTEN
PROTEINS
26
2.4.8.1
DURCHFUEHRUNG
DER
GELELEKTROPHORESE
26
2.4.8.2
FAERBEMETHODEN
26
_
INHALTSVERZEICHNIS
3
STRUKTUR/FUNKTIONS-KORRELATION
ESSENTIELLER
AMINOSAEURERESTE
DES
REKONSTITUIERTEN
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
3.1
EINLEITUNG
28
3.2
FUNKTIONELLE
KLASSIFIZIERUNG
VON
CYS
A
30
3.3
DIE
MODIFIKATION
DES
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
DURCH
DIDS
-
INTRAMOLEKULARE
VERBRUECKUNG
VON
CYS
A
UND
LYS
37
3.4
MODIFIKATION
DES
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
MIT
2.3-BUTANDION
(DIACETYL)
UND
PHENYLGLYOXAL
(PG)
-
IDENTIFIKATION
EINES
ARGININRESTES
40
3.5
RAEUMLICHE
UND
FUNKTIONELLE
INTERAKTION
ESSENTIELLER
AMINOSAEURERESTE
41
3.6
BETEILIGUNG
DER
IDENTIFIZIERTEN
AMINOSAEURERESTE
AM
UNPHYSIOLOGISCHEN
SUBSTRATTRANSPORT
44
3.7
DISKUSSION
45
3.7.1
STRUKTUR/FUNKTIONS-KORRELATION
ESSENTIELLER
AMINOSAEURERESTE
DES
REKONSTITUIERTEN
ASPARTAT/GLUTAMAT-CARRIERS
46
3.7.2
SCHLUSSFOLGERUNGEN
ZUR
TOPOLOGIE
DER
IDENTIFIZIERTEN
AMINOSAEUREN
49
3.7.3
SCHLUSSFOLGERUNGEN
ZUM
MOLEKULAREN
MECHANISMUS
DES
SUBSTRAT
TRANSPORTS
51
4
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
REKONSTITUIERTEN
PHOSPHATCARRIERS
AUS
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
4.1
EINLEITUNG
53
4.2
OPTIMIERUNG
DES
MESSSYSTEMS
54
4.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
PHOSPHATTRANSPORTS
59
4.3.1
ERMITTLUNG
DER
SUBSTRATAFFINITAETEN
DES
REKONSTITUIERTEN
PHOSPHAT
CARRIERS
61
4.3.2
EINFLUSS
EINES
MEMBRANPOTENTIALS
AUF
DEN
PHOSPHATTRANSPORT
63
4.3.3
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
AUF
DEN
PHOSPHATTRANSPORT
64
4.3.4
EINFLUSS
EINES
PROTONENGRADIENTEN
AUF
DEN
PHOSPHATTRANSPORT
65
4.4
KINETISCHE
BISUBSTRATANALYSEN
68
4.4.1
KINETISCHE
BISUBSTRATANALYSE
DER
PJ7PJ'-ANTIPORTFUNKTION
68
4.4.2
KINETISCHE
BISUBSTRATANALYSE
DES
ELEKTRONEUTRALEN,
UNIDIREKTIONALEN
PHOSPHATTRANSPORTS
71
4.5
DIE
HGCL2-INDUZIERTE,
UNPHYSIOLOGISCHE
EFFLUXFUNKTION
DES
PHOSPHAT
CARRIERS
AUS
RINDERHERZMITOCHONDRIEN
73
4.6
SENSITIVITAET
DES
REKONSTITUIERTEN
PHOSPHATCARRIERS
GEGENUEBER
ANIONEN
79
4.7
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
REKONSTITUIERTEN
PHOSPHATCARRIERS
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
81
4.7.1
DIE
INDUKTION
DER
UNPHYSIOLOGISCHEN
TRANSPORTFUNKTION
BEIM
PLCGC
84
4.8
DISKUSSION
86
4.8.1
GRUNDLEGENDE
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DES
PHOSPHATCARRIERS
87
4.8.2
BISUBSTRAT-MECHANISMUS
DES
PHOSPHATTRANSPORTS
91
4.8.3
ARGUMENTE
FUER
EINE
PF/OH'-ANTIPORTFUNKTION,
KATALYSIERT
DURCH
DEN
MITOCHONDRIALEN
PHOSPHATCARRIER
92
4.8.4
BILDUNG
DES
(KATALYTISCH-AKTIVEN)
TERNAEREN
KOMPLEXES
92
4.8.5
PHAENOMENOLOGIE
DER
HGCL2-INDUZIERTEN
EFFLUXFUNKTION
DES
PHOSPHAT
CARRIERS
94
4.8.6
MECHANISTISCHE
STUDIEN
ZUR
EFFLUXINDUKTION
BEIM
PHOSPHATCARRIER
96
5
ZUSAMMENFASSUNG
99
6
LITERATURVERZEICHNIS
101 |
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