Transport des Kompatiblen Solutes Glycinbetain in Halophilen Phototrophen Bakterien:
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1994
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INHALT
5
INHALT
SEITE
ABKUERZUNGEN I1
1. EINLEITUNG
1.1
HABITATE HALOPHILER MIKROORGANISMEN 13
1.2 KLASSIFIZIERUNG HALOTOLERANTER UND HALOPHILER
14
BAKTERIEN
1.3 OSMOREGULATION DURCH ELEKTROLYTE UND KOMPATIBLE 15
SOLUTE
1.4 DAS KOMPATIBLE SOLUT GLYCINBETAIN 17
1.5 ECTOTHIORHODOSPIRACEAE 20
1.6
THIOCAPSA HALOPHILA SG 3202 21
1.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 22
2. MATERIAL UND METHQDEN
2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 24
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME 24
2.1.2 ANZUCHT VON
ECTOTHIORHODOSPIRA HALOCHLORIS 24
2.1.3 ANZUCHT VERSCHIEDENER
ESCHERICHIA COLI STAEMME 26
2.1.4 ANZUCHT VON
THIOCAPSA HALOPHILA SG3202 26
2.1.5 STAMMKULTUREN UND REINHEITSKONTROLLE 26
2.1.6 WACHSTUMSPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 27
2.1.6.1 NASS- UND TROCKENGEWICHTSBESTIMMUNGEN 27
2.1.6.2 BESTIMMUNGEN DER OPTISCHEN DICHTE 27
2.1.6.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BICINCHONINSAEURE 27
METHODE (BCA)
2.1.7 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DES GLYCINBETAIN 28
TRANSPORTES
2.1.7.1 MEDIUM FUER TRANSPORTEXPERIMENTE 28
2.1.7.2 TRANSPORTPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 28
2.1.7.3 T ESTEN VERSCHIEDENER T RANSPORTPARAMETER 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALT
6
2.2
22 1
2
.
2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.4.1
2.2.42
2.2.43
2.2.44
2.2.5
2
.
2.6
2.2.7
2
.
2.8
2.2.9
2.2.9.1
2
.
2.10
2
.
2.11
2
.
2.12
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.2.1
24.2.2
24.2.3
SEITE
PROTEINCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 29
PUFFER UND LOESUNGEN 29
ZELLEMTE UND ZELLAUFSEHLUSS 30
GEWINNUNG PERIPLASMATISCHER PROTEINE 30
ENZYM-TESTS 3 J
MALAT-DEHYDROGENASE-TEST (E C. 1.1.37) 32
ZYKLISCHE PHOSPHODIESTERASE-TEST (E. C 3 1.4.16) 32
ALKALISCHE PHOSPHATASE-TEST (E.C. 3.1.3.1) 33
SUCCINAT-DEHYDROGENASE-TEST (E.C 1.3.99 1) 33
GEWINNUNG VON MEMBRANPROTEINEN 34
AMMONIUMSULFATFAELLUNGEN 34
ENTSALZEN VON PROTEINLOESUNGEN 35
ULTRAFILTRATION 35
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 35
AUTORADIOGRAPHIE VON POLYACRYLAMIDGELEN 36
NACHWEIS GLYCINBETAIN BINDENDER PROTEINE DURCH EINEN 37
[,4C]GLYCINBETAIN BINDEASSAY
ELEKTROBLOTTEN 37
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE METHODEN: ANIONEN-AUS- 37
TAUSCHCHROMATOGRAPHIE MIT EINER MONO Q SAEULE
IMMUNOLOGISCHE METHODEN
38
PUFFER UND LOESUNGEN 38
ANTIKOERPER 38
IMMUNOBLOT 38
PRAPARATION UND ANALYSE VON DESOXYRIBONUKLEIN- 39
SAEUREN (DNA)
PUFFER UND LOESUNGEN 39
PRAEPARATION UND ANALYSE VON DNA 40
PRAEPARATION GENOMISCHER DNA 40
CSCL/ETBR-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION UND AUFAR- 41
BEITUNG DER DNA
PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 41
INHALT
7
SEITE
2 4.2.4 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION UND REINHEIT VON 42
DNA
2.4.25 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 42
2.4.2 6 AUSWERTUNG VON AGAROSEGELEN 42
2 4.3 ENZYMATISCHE MANIPULATION VON DNA MIT RE- 43
STRIKTIONSENDONUKLEASEN _
2.4.4 AMPLIFIZIERUNG VON DNA MIT DER POLYMERASE CHAIN 43
REACTION (PCR)
2.4.41 BERECHNUNG DER SCHMELZTEMPERATUR VON PRIMERN 44
2.4.5 ANALYSE VON DNA FRAGMENTEN DURCH SOUTHERN 45
BLOTTING UND HYBRIDISIERUNGEN
2.4 5.1 DNA-TRANSFER DURCH SOUTHEM-BLOTTING 45
2.4.5.2 HYBRIDISIERUNG MIT DIG-LL-DUTP MARKIERTEN SONDEN 46
UND DETEKTION DER HYBRIDE
2.5 SONSTIGE METHODEN DER SYNTHESE UND ANALYSE 47
2.5.1 SYNTHESE VON {
14C]GLYCINBETAIN 47
2.5.2 MIKROEXTRAKTION KOMPATIBLER SOLUTE 48
2.5.3 SPEKTRALPHOTOMETRISCHER NACHWEIS VON GLYCINBETAIN 49
MIT REINECKESALZ
2.5.4 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 49
2.5.4.1 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 49
25.4.2 HIGH-PERFORMANCE-LIQUID-CHROMATOGRAPHY (HPLC) 49
2.6 HERKUNFT DER CHEMIKALIEN, ENZYME UND GERATE 50
3. ERGEBNISSE
3.1 ANALYTISCHE METHODEN ZUM QUANTITATIVEN UND QUALI- 52
TATIVEN NACHWEIS VON GLYCINBETAIN
311 HPLC-MESSUNGEN ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG VON 53
GLYCINBETAIN
3 12 GLYCINBETAIN BESTIMMUNG MIT DER REINECKESALZ 52
METHODE
INHALT
8
SEITE
3.1.3 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHER NACHWEIS VON GLY- 53
CINBETAIN
3.2 WACHSTUMSPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AN
E. HA- 55
LOCHLORIS
3.2.1 BESTIMMUNGEN DER WACHSTUMSRATEN UND INTRGZELLU- 55
LAEREN GLYCINBETAIN KONZENTRATIONEN VON
E. HALOCHLO
RIS
IN ABHAENGIGKEIT VON DER SALINITAET UND DEM GLYCIN
BETAIN GEHALT DES MEDIUMS
3.2.2 ERMITTLUNG DER MAXIMALEN SALZKONZENTRATIONSAEN- 57
DERUNG, DER
E. HALOCHLORIS AUSGESETZT WERDEN KANN
3.3 ENZYMATISCHE SYNTHESE VON GLYCINBETAIN 58
3.4 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DES GLYCINBETAIN 60
TRANSPORTES
3.4.1 ZEIT- UND KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DES GLYCINBE- 62
TAIN TRANSPORTES
3.4.2 PH-WERT UND TEMPERATURABHAENGIGKEIT DES GLYCINBE- 65
TAIN TRANSPORTES
3 .4.3 EFFEKTE POTENTIELLER METABOLISCHER INHIBITOREN AUF DEN 67
GLYCINBETAIN TRANSPORT VON
E. HALOCHLORIS
3 .4.4 STRUKTURELLE SPEZIFITAET DES GLYCINBETAIN TRANSPORTES 71
3.4.5 KONSTITUTIVITAET DES GLYCINBETAIN TRANSPORTSYSTEMS 72
3.5 PROTEINCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 73
3.5.1 FRAKTIONIERUNG VON
E. HALOCHLORIS ZELLEN IN MEM- 74
BRANFRAKTION UND PERIPLASMATISCHE FRAKTION
3 5.1.1 GEWINNUNG PERIPLASMATISCHER PROTEINE 74
3.5.1.2 GEWINNUNG BAKTERIELLER MEMBRANEN 81
3.5.2 IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN BAKTERIELLER ZELL- 83
FRAKTIONEN
3.5.3 ANREICHERUNG DES PERIPLASMATISCHEN GLYCINBETAIN 86
BINDENDEN PROTEINS AUS
E. HALOCHLORIS
INHALT
9
3.5.4
3.5.5
AUTORADIOGRAPHISCHER NACHWEIS DES GLYCINBETAIN BIN
DENDEN PROTEINS
NACHWEIS DES PERIPLASMATISCHEN GLYCINBETAIN BINDEN
DEN PROTEINS DURCH EINEN [
,4C]GLYCINBETAIN BINDE-
ASSAY
SEITE
87
88
3.6 ERGEBNISSE GENETISCHER UNTERSUCHUNGEN 89
3.6.1 ENTWICKLUNG HETEROLOGER SONDEN FUER DIE GENE DER 89
PROU UND PROP TRANSPORTSYSTEME KODIERENDEN BE
REICHE IM E. HALOCHLORIS CHROMOSOM
3.6 1.1 ENTWICKLUNG HETEROLOGER SONDEN FUER DIE
PROX, PROW 89
UND
PROV GENE HOMOLOGEN BEREICHE IM E. HALOCHLORIS
CHROMOSOM
3.6.1.2 ENTWICKLUNG EINER HETEROLOGEN SONDE FIIR
PROP 92
HOMOLOGE BEREICHE IM
E. HALOCHLORIS CHROMOSOM
3.6.2 HYBRIDISIERUNGEN RESTRINGIERTER, GENOMISCHER DNA MIT 93
DIG-LL-DUTR MARKIERTEN SONDEN ZUM NACHWEIS DER
GENE DER PROU UND PROP TRANSPORTSYSTEME
4. DISKUSSION
4.1
RELATION ZWISCHEN WACHSTUMSPARAMETERN UND GLY- 96
CINBETAIN KONZENTRATIONEN
4.2 SYNTHESE UND REINIGUNG VON [
14C]GLYCINBETAIN
4.3 PHYSIOLOGIE DES GLYCINBETAIN TRANSPORTES
4.4 SPEZIFISCHE FREISETZUNG PERIPLASMATISCHER PROTEINE,
UND IMMUNOLOGISCHER UND AUTORADIOGRAPHISCHER
NACHWEIS EINES GLYCINBETAIN BINDENDEN, PERIPLASMA
TISCHEN PROTEINS AUS & HALOCHLORIS
98
98
105
4.5 SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN UND AUTO- 107
RADIOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG MIT [
14C]GLYCINBETAIN
INHALT
10
SEITE
4.6 ERGEBNISSE GENETISCHER UNTERSUCHUNGEN 108
4.7 ENTWICKLUNG EINES MODELLS FLIR DIE AUFNAHME VON 108
GLYCINBETAIN DURCH
E. HALOCHLORIS
5. ZUSAMMENFASSUNG ^ 111
6. LITERATUR
IN
7. ANHANG 125 |
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