Charakterisierung der proteolytischen und immunologischen Eigenschaften des Tumor-Markers Prostata-Spezifisches-Antigen (PSA):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKURZUNGSVERZEICHNLS
L
EINLEITUNG
1
1.1
PROSTATA-SPEZIFISCHES-ANTIGEN
(PSA)
ALS
TUMOR-MARKER
1
1.2
SAMENPLASMA-PROTEINE
1
1.3
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
PSA
1
1.3.1
HISTORISCHES
ZU
PSA
1
1.3.2
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
PSA
3
1.3.3
STRUKTUR
VON
PSA
4
1.3.4
SUBSTRATSPEZIFITAET
VON
PSA
S
1.3.4.1
REAKTIONEN
VON
PSA
MIT
REDUZIERTEM,
ALKYLIERTEM
LYSOZYM
UND
OXIDIERTER
INSULIN-B-KETTE
8
1.3.S
AUTOPROTEOLYSE
VON
PSA
8
1.3.6
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
PSA
9
1.3.7
PSA
ALS
KOMPLEXBILDNER
9
1.3.8
IMMUNOLOGISCHE
SPEZIFITAET
VON
PSA
UND
ANTIKOERPER
GEGEN
PSA
9
2.
AUFGABENSTELLUNG
10
3.
MATERIALIEN
11
3.1
SAMENPLASMA
(SPD
11
3.2
KANINCHEN
11
3.3
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
11
3.4
ENZYME
UND
INHIBITOREN
11
3.S
SAEULEN
ZUR
CHROMATOGRAPHISCHEN
REINIGUNG
VON
PSA
11
3.S.1
GERAETE
ZUR
CHROMATOGRAPHISCHEN
REINIGUNG
VON
PSA
11
3.6
ZENTRIFUGEN
12
3.7
GERAETE
FTIR
DIE
HPLC
(HIGH-PERFORMANCE-LIQUID-CHROMATOGRAPHY)
12
3.7.1
HPLC
NIEDERDRUCK
GRADIENTEN
SYSTEM
VON
PHARMACIA
12
3.7.2
HPLC
HOCHDRUCK
GRADIENTEN
SYSTEM
VON
SHIMADZU
13
I.
METHODEN
4.1
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PSA
AUS
SAMENPLASMA
4.1.1
ISOLIERUNG
VON
PSA
MITTELS
PRAEPARATIVER
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTRO
PHORESE
(SDS-PAGE)
UND
ANSCHLIESSENDER
ELEKTROELUTION
14
4.1.2
ISOLIERUNG
VON
PSA
AUS
SPL
MITTELS
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UND
ANSCHLIESSENDER
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
(IEC)
AUF
MONO
Q
HR
S/5
14
4.1.3
ISOLIERUNG
VON
PSA
AUS
SPL
MITTELS
AFFLNITAETSCHROMTOGRAPHIE
UND
AN
SCHLIESSENDER
IEC
MIT
Q-SEPHAROSE
FF
IS
4.1.3.1
REINIGUNG
DER
PSA
ELUATE
NACH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UND
IEC
MIT
HILFE
DER
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
(GPC)
AUF
SUPEROSE
12
16
4.1.4
ISOLIERUNG
VON
PSA
AUS
SPL
MITTELS
IEC
AUF
SEPHADEX
C
SO
UND
AN
SCHLIESSENDER
GPC
AUF
SEPHACRYL
S
200
NACH
SENSABAUGH
UND
BLAKE
(1990)
UND
GRAVES
ET
AL.
(1990)
16
4.2
GELELEKTROPHORESEN
16
4.2.1
VERTIKALE
SDS-PAGE
16
4.2.2
HORIZONTALE
SDS-PAGE
IN
ULTRADUENNEN
GELEN
17
4.3
WESTERN-BLOTTING
19
4.3.1
INDLA-INK-FAERBUNG
19
4.4
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
19
4.4.1
IMMUNO-BLOT
19
4.4.2
DOT-IMMUNOBINDING-TEST
ZUR
BESTIMMUNG
DER
IMMUNGLOBULIN-KLASSEN
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
20
4.4.3
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
UND
SERUMGEWINNUNG
20
4.4.4
ENZYMIMMUNTEST
(ELISA)
22
4.S
PROTEINBESTIMMUNGEN
22
4.S.1
ABSORPTION
BEI
280
NM
22
4.S.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
23
4.S.3
PROTEINBESTIMMUNG
MIT
2,2'-BICHINCHONINSAEURE
DINATRIUMSALZ
(BCA)
23
4.6
DERIVATISIERUNGSMETHODEN
FUER
PROTEINE
23
4.6.1
ALKYLIERUNG
MIT
VINYLPYRIDIN
(VP)
23
4.6.2
ALKYLIERUNG
MIT
JODESSIGSAEURE
OES)
24
4.6.3
ALKYLIERUNG
MIT
3-BROMPROPYLTRIMETHYLAMMONIUMBROMID
(BR-PTMA-BR)
24
4.6.4
PERAMEISENSAEURE-OXIDATON
VON
PROTEINEN
(NACH
HIRS,
1967)
24
4.6.S
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
CASEIN
24
4.7
SPALTUNGEN
VON
DERIVATISIERTEN
PROTEINEN
2S
4.7.1
CHEMISCHE
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
MIT
BROMCYAN
(BRCN)
2S
4.7.2
ENZYMATISCHE
SPALTUNGEN
VON
DERIVATISIERTEM
LYSOZYM
25
4.7.2.1
SPALTUNG
VON
PYRIDYLETHYL
(PE)-,
CARBOXYMETHYL
(CM)-LYSOZYM
UND
TRIMETHYLAMMONIUMPROPYL-LYSOZYM-BROMID
(PTMA)
MIT
TRYPSIN
25
4.7.2.2
SPALTUNG
VON
PE
UND
PTMA-LYSOZYM
MIT
ENDOPROTEINASE
ARG-C
25
4.7.2.3
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
MIT
ENDOPROTEINASE
LYS-C
25
4.7.2.4
SPALTUNG
VON
LYSOZYMDERIVATEN
MIT
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
PROTEASE
V8
25
4.8
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
VON
PTMA-LYSOZYM
MIT
TRYPSIN
26
4.9
DERIVATISIERUNG
DER
CARBOXYLGRUPPEN
TRYPTISCHER
PEPTIDE
DES
PTMA
26
LYSOZYMS
4.10
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PSA
26
4.10.1
PROTEASEAKTIVITAETSTEST
VON
PSA
MIT
N,N'-DIMETHYLCASEIN
(DMC)
ALS
SUBSTRAT
26
4.10.2
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PSA
MIT
HILFE
VON
PROTEINEN
ALS
SUBSTRAT
27
4.10.3
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PSA
MIT
HILFE
VON
PEPTIDEN,
DIE
DURCH
CHEMISCHE
UND
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
ERHALTEN
WURDEN
27
4.10.4
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PSA
MIT
HILFE
VON
TRYPTISCHEN
PEPTIDEN
DES
PTMA-LYSOZYMS,
DIE
NACH
LIMITIERTER
PRO
TEOLYSE
ERHALTEN
WURDEN
27
4.11
IDENTIFIZIERUNG
DER
TRYPTISCHEN
PEPTIDE
DES
PTMA-LYSOZYMS,
DIE
NACH
LIMITIERTER
PROTEOLYSE
ERHALTEN
WURDEN
28
4.12
EINFLUSS
DER
INHIBITOREN
TPCK,
TLCK
UND
PMSF
AUF
DIE
PROTEOLY
TISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
28
4.13
EINFLUSS
VON
TWEEN
20
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
28
4.14
EINFLUSS
VON
GLYCERIN
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
29
4.15
EINFLUSS
VON
HARNSTOFF
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
29
4.16
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
PUFFER
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
29
4.17
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PSA
29
4.18
SEQUENZIERUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEUREN
VON
PEPTIDEN
NACH
DER
DOPPELKUPPLUNGSMETHODE
MIT
4-DIMETHYLAMINOAZOBENZOL-4'-ISO
THIOCYANAT/PHENYLISOTHIOCYANAT
(DABITC/PITC)
29
4.19
AMINOSAEUREANALYSE
(ASA)
$0
5.
ERGEBNISSE
32
S1
5.1
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PSA
AUS
HUMANEM
SAMENPLASMA
(SPD
32
5.1.1
ISOLIERTES
PSA
AUS
SPL
NACH
TRENNUNG
IN
DER
PRAEPARATIVEN
SDS
PAGE
MIT
ANSCHLIESSENDER
KUPFERFAERBUNG
UND
ELEKTROELUTION
32
5.1.2
ISOLIERTES
PSA
AUS
HUMANEM
SPL
NACH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UND
ANSCHLIESSENDER
TRENNUNG
MIT
HILFE
DER
LONENAUSTAUSCHCHRO
MATOGRAPHIE
(IEC)
AUF
MONO
Q
HR
5/5
33
5.1.3
ISOLIERTES
PSA
AUS
SPL
NACH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UND
LONEN
AUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
(IEC)
AUF
Q-SEPHAROSE
FF
35
5.1.3.1
REINIGUNG
VON
PSA
NACH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UND
IEC
AUF
Q-SEPHAROSE
FF
MIT
HILFE
DER
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
(GPC)
AUF
SUPEROSE
12
37
5.1.4
ISOLIERUNG
VON
PSA
MIT
HILFE
DER
IEC
AUF
CARBOXYMETHYLCELLULOSE
(CM)-SEPHADEX
C
50
UND
ANSCHLIESSENDER
GPC
AUF
SEPHACRYL
S
200
NACH
SENSABAUGH
UND
BLAKE
(1990)
38
5.2
PSA
UNTER
NICHTREDUZIERENDEN
UND
REDUZIERENDEN
BEDINGUNGEN
IN
DER
SDS-PAGE
-
AUTOPROTEOLYSE
VON
PSA
40
5.3
ERGEBNISSE
DER
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
SPL
UND
ISOLIER
TEM
PSA
IM
ELISA
42
5.3.1
VERLAUF
DER
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
ISOLIERTEM
PSA
43
5.4
REAKTIONEN
MONOKLONALER
ANTI-PSA
ANTIKOERPER
IM
ELISA
43
5.4.1
SUBTYPISIERUNG
DER
MAK
IM
ELISA
44
5.S
REAKTIONEN
DER
ANTI-PSA-SEREN
UND
ANTI-PSA
ANTIKOERPER
IM
IMMUNO-BLOT
45
5.5.1
IMMUNO-BLOT
DER
KANINCHEN-SEREN
MIT
REDUZIERTEM
UND
NICHTREDU
ZIERTEM
SPL
ALS
ANTIGEN
45
5.5.2
REAKTIONEN
DER
ANTI-PSA-SEREN
IM
IMMUNO-BLOT
MIT
NICHTREDUZIER
TEM
UND
REDUZIERTEM,
ISOLIERTEN
PSA
47
5.5.3
REAKTIONEN
MURINER,
MONOKLONALER
ANTI-PSA
ANTIKOERPER
IM
IMMUNO
BLOT
MIT
NICHTREDUZIERTEM
UND
REDUZIERTEM
PSA
47
5.5.4
IMMUNO-BLOT
DES
ISOLIERTEN
PROTEINS
MIT
EINEM
MG
VON
70
KDA
UND
KANINCHEN
SEREN
48
5.6
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
48
5.6.1
PROTEOLYTSICHE
AKTIVITAET
VON
PSA
IM
DIMETHYLCASEIN-TEST
48
5.6.2
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
GEGENUEBER
REDUZIERTEN,
ALKYLIERTEN
PROTEINEN
49
S.6.2.1
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
DURCH
PSA
UND
DETEKTION
MIT
HILFE
DER
HPLC
S.6.2.2
SPALTUNG
VON
PTMA-A-LACTALBUMLN
MIT
PSA
52
S.7
IDENTIFIZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
PEPTIDE
NACH
SPALTUNG
VON
PTMA
LYSOZYM
MIT
PSA
UND
WEITERSPALTUNG
MIT
TRYPSIN
55
S.8
TEILSEQUENZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
PEPTIDE
NACH
SPALTUNG
VON
PTMA-
LYSOZYM
MIT
PSA
57
S.9
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
PEPTIDE
NACH
SPALTUNG
VON
PTMA
A-LACTALBUMIN
MIT
PSA
59
S.10
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
64
S.10.1
BESTIMMUNG
DER
MICHAELISKONSTANTEN
K
M
FLIR
PSA
UND
PTMA-LYSO
ZYM
ALS
SUBSTRAT
64
S.10.2
KINETIK
DER
SPALTUNG
VON
PTMA-A-LACTALBUMIN
DURCH
PSA
64
5.11
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
GEGENUEBER
PEPTIDEN,
DIE
DURCH
CHEMISCHE
UND
ENZYMATISCHE
SPALTUNGEN
VON
PTMA-LYSOZYM
HERGESTELLT
WURDEN
64
S.11.1
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
MIT
TRYPSIN
69
S.11.2
INKUBATION
DER
TRYPTISCHEN
PEPTIDE
DES
PTMA-LYSOZYMS
MIT
PSA
69
S.11.3
INKUBATION
DER
TRYPTISCHEN
PEPTIDE
VON
PE
UND
CM-LYSOZYM
MIT
PSA
70
S.11.3.1
INKUBATION
TRYPTISCHER
PEPTIDE
DES
PTMA-LYSOZYMS
MIT
CHYMO
TRYPSIN
70
S.11.4
INKUBATION
DERIVATISIERTER
TRYPTISCHER
PEPTIDE
DES
PTMA-LYSOZYMS
MIT
PSA
70
S.11.S
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
MIT
HILFE
VON
PEPTIDEN,
DIE
DURCH
VOLLSTAENDIGE
PROTEOLYTISCHE
UND
CHEMISCHE
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
ERHALTEN
WURDEN
70
5.11.6
REAKTION
VON
PSA
MIT
TRYPTISCHEN
PEPTIDEN
DES
PTMA-LYSOZYMS,
DIE
DURCH
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
ERHALTEN
WURDEN
73
5.12
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
GEGENUEBER
TRYPTISCHEN
PEPTIDEN
DES
PTMA-A-LACTALBUMINS
78
5.13
EINFLUSS
VON
TPCK,
TLCK
UND
PMSF
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVI
TAET
VON
PSA
79
5.14
EINFLUSS
VON
TWEEN
20
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
79
5.15
EINFLUSS
VON
GLYCERIN
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
80
5.16
EINFLUSS
VON
HARNSTOFF
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
80
5.17
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
PUFFER
AUF
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
80
5.18
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
SPALTUNG
VON
PTMA-LYSOZYM
DURCH
PSA
80
5.19
STABILITAET
VON
PSA
81
S.20
VERGLEICH
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VERSCHIEDENER
PSA
PRAEPARATIONEN
81
6.
DISKUSSION
82
6.1
ISOLIERUNGEN
VON
PSA
82
6.2
IMMUNOLOGISCHE
REAKTIONEN
VON
PSA
85
6.3
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
VON
PSA
87
7.
ZUSAMMENFASSUNG
94
8.
LITERATURVERZEICHNIS
97
ANHANG
LEBENSLAUF
DANKSAGUNG
EIDESSTATTLICHE
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