Synthetische Oligonucleotide als allelspezifische Sonden für Antithrombin III Mutationen, sowie zur Detektion hypervariabler Bereiche im menschlichen Genom:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
|
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| Beschreibung: | Tübingen, Univ., Diss., 1993 (Nur beschränkt für den Austausch) |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
EINLEITUNG
.
1
II
GRUNDLAGEN
.
3
1.
OLIGONUCLEOTIDSYNTHESE
.
3
2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
SYNTHETISCHEN
OLIGONUCLEOTIDEN
.
3
2.1.
AUSWAHL
DER
OLIGONUCLEOTIDSEQUENZ
.
3
2.2.
HYBRIDISIERUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
OLIGONUCLEOTIDEN
.
4
2.3.
MARKIERUNG
VON
OLIGONUCLEOTIDEN
.
4
3.
ALLELSPEZIFISCHE
OLIGONUCLEOTIDSONDEN
FUER
ANTITHROMBIN
III
.
5
3.1.
ALLELSPEZIFISCHE
OLIGONUCLEOTIDE
.
5
3.2.
ANTITHROMBIN
III
.
6
4.
DNA-POLYMORPHISMEN
.
7
4.1.
RESTRIKTIONSFRAGMENTLAENGEN-POLYMORPHISMEN
.
8
4.2.
MINISATELLITEN
.
8
4.3
EINFACHE
REPETITIVE
SEQUENZEN
.
9
5.
HYPERVARIABLE
DNA-SONDEN
.
10
5.1.
MULTI-LOCUS
SONDEN
.
11
5.2.
SINGLE-LOCUS
SONDEN
.
11
III
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
1.
MATERIAL
.
12
1.1.
UNTERSUCHUNGSGUT
.
12
1.2.
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
.
12
1.3.
ANTIKOERPER
.
13
1.4.
ENZYME
.
13
1.5.
OLIGONUCLEOTIDE
.
13
1.5.1.
ANTITHROMBIN
III
PCR
PRIMERSEQUENZEN
.
13
1.5.2.
ALLELSPEZIFISCHE
OLIGONUCLEOTIDE
.
14
1.5.3.
OLIGONUCLEOTIDE
FUER
MULTI-LOCUS
DETEKTION
.
16
1.5.4.
OLIGONUCLEOTIDE
FUER
SINGLE-LOCUS
DETEKTION
.
16
1.5.5.
PRIMER
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
.
16
1.6.
MEDIEN
.
17
1.7.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
17
1.7.1.
ALLGEMEINE
PUFFER
.
17
1.7.2.
LOESUNGEN
FUER
DIE
HYBRIDISIERUNG
.
19
1.7.3.
PUFFER
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
.
20
1.7.4.
PUFFER
FUER
DEN
NICHTRADIOAKTIVEN
NACHWEIS
.
20
1.8.
REAGENTIEN
.
21
1.8.1.
AGAROSEN
.
21
1.8.2.
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
21
1.8.3.
KITS
.
21
1.8.4.
MEMBRANEN
.
21
1.8.5.
CHEMIKALIEN
FUER
DIE
DNA-SYNTHESE
.
22
2.
METHODEN
.
22
2.1.
DNA-ISOLIERUNG
.
22
2.1.1.
ISOLIERUNG
VON
HUMAN-DNA
.
22
2.1.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
22
2.2.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
22
2.3.
OHGONUCLEOTIDSYNTHESE
.
23
2.4.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
23
2.4.1.
PCR-BEDINGUNGEN
.
24
2.4.2.
KONTROLLE
DER
PCR
REAKTION
.
25
2.4.3.
REINIGUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
25
2.5.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
.
25
2.6.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
GENOMISCHER
DNA
.
26
2.7.
SOUTHERN
BLOT
UND
WESTERN
BLOT
.
26
2.7.1.
SOUTHERN
BLOT
.
26
2.7.2.
WESTERN
BLOT
.
27
2.8.
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
27
2.9.
KLONIERUNG
VON
DNA
.
27
2.9.1.
METHODISCHES
PRINZIP
DER
DNA-KLONIERUNG
.
27
2.9.2.
PHOSPHATASE
BEHANDLUNG
FREIER
DNA-ENDEN
.
28
2.9.2.1.
CIP-VERDAU
.
28
2.9.2.2.
PHENOLEXTRAKTION
.
28
2.9.3.
LIGATION
.
29
2.9.4.
TRANSFORMATION
.
29
2.9.5.
SELEKTION
VON
POSITIVEN
KLONEN
.
30
2.10.
HYBRIDISIERUNG
.
31
2.10.1.
MARKIERUNG
DER
OLIGONUCLEOTIDE
MIT
DIGOXIGENIN
.
31
2.10.2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
ASO'S
FUER
ANTITHROMBIN
III
.
31
2.10.3.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
BLOTS
.
31
2.11.
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
.
31
2.11.1.
SEQUENZREAKTION
.
34
2.11.2.
GIESSEN
DES
SEQUENZGELS
.
35
2.12.
NICHTRADIOAKTIVE
DETEKTION
.
35
2.12.1.
NICHTRADIOAKTIVER DETEKTION
VON
PROTEINEN
.
35
2.12.2.
NICHTRADIOAKTIVE
DETEKTION
VON
DNA
.
36
IV
ERGEBNISSE
.
38
1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTITHROMBIN
III
VARIANTEN
.
38
1.1.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
38
1.2.
PCR
UND
DOT-BLOT
ANALYSE
.
39
2.
ENTWICKLUNG
EINER
SINGLE-LOCUS-SONDE
AUS
EINEM
MULTI-LOCUS
FINGERPRINT
.
42
2.1.
STRATEGIE
.
42
2.2.
HERSTELLUNG
EINES
MULTI-LOCUS-FINGERPRINT
.
42
2.3.
KLONIERUNG
.
44
2.4.
UNTERSUCHUNG
DES
KLONIERTEN
DNA-FRAGMENTES
.
45
2.4.1.
RESTRIKTIONSANALYSE
.
45
2.4.2.
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
.
48
2.4.3.
SEQUENZVERGLEICH
.
51
2.5.
SINGLE-LOCUS-SONDE
.
51
2.5.1.
POPULATIONSGENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
MIT
OLIGO
2
.
52
2.5.2.
FORMALGENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
MIT
OLIGO
2
.
55
V
DISKUSSION
.
58
1.
SYNTHETISCHE
ALLEISPEZIFISCHE
OLIGONUCLEOTIDSONDEN
.
58
2.
HYPERVARIABLE
SONDEN
.
59
2.1.
MULTI-LOCUS-SONDE
UND
SINGLE-LOCUS-SONDE
IN
DER
FORENSIK
.
59
2.2.
MULTI-LOCUS-FINGERPRINT
MIT
SONDE
(ATTTT)5
.
60
2.3.
KLONIERUNG
.
61
2.4.
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
.
62
2.5.
SINGLE-LOCUS-SONDE
.
64
2.5.1.
LOCUS
1
.
64
2.5.2.
LOCUS
2
.
65
3.
SYNTHETISCHE
OLIGONUCLEOTIDE
IN
DER
MOLEKULARGENETISCHEN
FORSCHUNG
.
66
VI
ZUSAMMENFASSUNG
_
.
_
_
.
-
.
-----
.
67
VII
LITERATURVERZEICHNIS:
.
69
VIII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS:
.
80
IX
FIRMEN:
.
83 |
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