Isolierung und Charakterisierung eines Kaliumkanalgens aus der Ratte:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
|
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| Beschreibung: | Bochum, Univ., Diss., 1993 |
| Beschreibung: | 79 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTS
VERZEICHNIS
A
EINLEITUNG
1
B
MATERIAL
UND
METHODEN
1
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
UND
NAEHRMEDIEN
4
1.1
BAKTERIENSTAEMME
4
1.2
NAEHRMEDIEN
4
2
ISOLIERUNG
VON
KLONEN
AUS
EINER
GENOMISCHEN
BIBLIOTHEK
S
2.1
VERWENDETE
GENOMISCHE
RATTENBIBLIOTHEK
S
2.2
AUSPLATTIEREN
VON
X-PHAGEN
UND
HERSTELLUNG
VON
FILTERABZIIGEN
S
2.3
HYBRIDISIERUNG
DER
FILTERABZIIGE
UND
VEREINZELUNG
VON
X-PHAGEN
S
3
DNA-ISOLIERUNG
6
3.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
RATTENGEHIM
6
3.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
7
3.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
2
ML
KULTUREN
7
3.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
100
ML
KULTUREN
7
3.2.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
150-500
ML
KULTUREN
8
3.3
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
BLUESCRIPT-DNA
8
3.4
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN-DNA
AUS
KLEINEN
LYSATEN
9
4
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
9
S
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
9
NUKLEINSAEUREN
5.1
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
9
5.2
AUFFUELLEN
VON
UEBERHAENGENDEN
5'-ENDEN
9
5.3
BEHANDLUNG
MIT
T4-DNA-POLYMERASE
10
5.4
BEHANDLUNG
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
10
5.5
VERLAENGERUNG
DES
3'
-ENDES
VON
SSDNA
MIT
TERMINALER
1
0.
DESOXYNUKLEOTIDYLTRANSFERASE
(TDT)
5.6
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
10
5.6.1
PRAEPARATION
DER
VEKTOREN
11
5.6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
DURCH
PHENOL/CHCLG
11
EXTRAKTION
5.6.3
LIGATION
1
1
5.6.4
PRAEPARATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
11
S.6.S
TRANSFORMATION
11
5.7
ISOLIERUNG
UND
ZIRKULARISIERUNG
VON
GENOMISCHEN
DNA
FRAGMENTEN
1
2
5.8
DNASE
I
DELETIONEN
12
5.9
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
1
3
5.10
SYNTHESE
VON
ERSTSTRANG-CDNA
1
3
S.LF
SYNTHESE
VON
ERSTSTRANG-CDNA
MIT
SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
14
5.12
DNA-AMPLIFIKATION
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
14
5.13
"PRIMER
EXTENSION"
14
6
GELELEKTROPHORESE
15
6.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNA
15
6.2
PULSFELDELEKTROPHORESE
VON
GENOMISCHER
DNA
15
6.3
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
16
7
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
16
8
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
16
8.1
DNA-MARKIERUNG
MIT
HILFE
VON
HEXANUKLEOTIDEN
16
8.2
S'-ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
1
7
9
HYBRIDISIERUNG
AN
IMMOBILISIERTE
DNA
1
7
10
AUTORADIOGRAPHIE
1
8
11
ZELLKULTUR
18
11.1
VERWENDETE
ZELLINLEN
18
11.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
PLASMID-DNA
IN
KULTURZELLEN
1
8
11.3
RNA-ISOLIERUNG
AUS
PC12-ZELLEN
19
12
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
19
12.1
PRAEPARATION
VON
CAT-EXTRAKTEN
19
12.2
BESTIMMUNG
DER
CAT-AKTIVITAET
20
12.3
PRAEPARATION
VON
PC12-ZELLMEMBRANEN
20
12.4
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UND
WESTERN-BLOT-ANALYSE
21
C
ERGEBNISSE
1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
RCK4-GENS
23
1.1
KOMPLETTIERUNG
DER
RCK4
CDNA
MIT
HILFE
DER
VERANKERTEN
PCR
23
1.2
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
TEILBEREICHEN
DES
RCK4-GENS
26
1.3
ISOLIERUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
GENOMISCHEN
RCK4-DNA
28
1.4
SEQUENZIERUNG
DER
GENOMISCHEN
RCK4-DNA
30
1.5
KARTIERUNG
VON
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTEN
31
1.6
NUKLEINSAEURESEQUENZ
DES
RCK4-GENS
33
1.7
VERGLEICH
DER
CDNA-SEQUENZEN
MIT
DEN
GENOMISCHEN
SEQUENZEN
39
1.8
ANALYSE
DER
RCK4-PROMOTORREGLON
40
2
NACHWEIS
DER
IN
VIVO
FUNKTIONALITAET
DES
ISOLIERTEN
RCK4
PROMOTORS
41
2.1
KONSTRUKTION
DER
RCK4/CAT-PLASMIDE
41
2.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
IN
HELA-ZELLEN
43
3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GEWEBSSPEZIFISCHEN
EXPRESSION
DES
RCK4-GENS
45
3.1
MUSKELSPEZIFISCHE
EXPRESSION
45
3.1.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
IN
PRIMAERE
MUSKELZELLEN
DER
RATTE
45
3.1.2
TRANSIENTE
KOTRANSFEKTION
IN
N1H3T3-ZELLEN
47
3.1.3
KARTIERUNG
DES
IN
VIVO
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES
VON
TRANSFERIERTEN
PRIMAEREN
MUSKELZELLEN
DER
RATTE
48
3.2
NEURONALE
EXPRESSION
SO
3.2.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
IN
PC12-ZELLEN
51
3.2.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
RCK4-PROTEINS
IN
PC12-ZELLEN
52
3.2.3
TRANSIENTE
KOTRANSFEKTIONEN
IN
HELA-ZELLEN
53
3.2.3.1
ISOLIERUNG
DER
NGF-IA-CDNA
UND
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PDKK-NGF-LA
53
3.2.3.2
EINFLUSS
VON
DEXAMETHASON
UND
FORSKOLIN
AUF
DIE
RCK4-PROMOTORAKTIVITAET
54
3.2.3.3
EINFLUSS
VON
NGF-IA
AUF
DIE
RCK4-PROMOTORAKTIVITAET
56
D
DISKUSSION
59
E
ZUSAMMENFASSUNG
69
F
LITERATURVERZEICHNIS
70
G
ANHANG
1
78 |
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