Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pisum sativum L.: Zellkompetenz und Transfer relevanter Gene
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1993
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| Beschreibung: | Bonn, Univ., Diss., 1993 (Nicht für den Austausch) |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG [1-16]
1.1. HISTORIE, SYSTEMATIK UND BEDEUTUNG 1
1.2. ZUECHTUNGSZIELE - ZUECHTUNGSPROBLEMATIK 3
1.3.
IN V/YRO-KULTUR UND REGENERATION VON ERBSEN 5
1.4. DAS
AGROBACTERIUM-SYSTEM 8
1.5.
AGROBACTERIUM-VERMITTELTE TRANSFORMATION VON LEGUMINOSEN 9
1.6. ZELLKOMPETENZ FUER DIE TRANSFORMATION 12
1.7. RELEVANTE GENE: HERBIZID- UND VIRUSRESISTENZ 13
2 MATERIAL UND METHODEN [17-33]
2.1. BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE, 17
2.2. PFLANZENMATERIAL 18
2.2.1. ERBSEN 18
2.2.2. NICOTIANA 18
2.3. PFLANZENMEDIEN, CHEMIKALIEN UND ALLGEMEINE KULTURBEDINGUNGEN 18
2.4. PFLANZLICHE GEWEBEKULTUR UND TRANSFORMATION 19
2.4.1. ANZUCHT, PRAEPARATION UND INOKULATION DER GEWEBE 19
2.4.2. KO-KULTUR UND KONTROLLE DES BAKTERIEN-WACHSTUMS 20
2.4.3. SPROSS-UND KALLUSKULTUREN 21
2.5. TRANSFORMATION DER BAKTERIEN 21
2.5.1. ELEKTROPORATION 21
2.5.2. BIPARENTALES MATING 22
2.5.3. KETOLACTOSE-TEST 23
2.5.4. PLASMIDISOLATION , 23
2.5.5. VEKTORKONSTRUKTION 24
2.6. TRANSFORMATION VON ERBSEN MIT PLASMID-DNA 24
2.6.1. PARTIKELKANONE 24
2.6.2. PEG-VERMITTELTE TRANSFORMATION VON PROTOPLASTEN 25
2.7. HISTOLOGIE 26
2.8. ANALYSE DES TRANSFORMIERTEN GEWEBES 26
2.8.1. NACHWEIS DER SS-GLUCURONIDASE-AKTIVITAET 26
2.8.1.1. HISTOCHEMISCH 26
2.8.1.2. IN SITU-NACHWEIS VON EHA101C3 26
2.8.1.3. FLUORIMETRISCH 26
2.8.2. PHOSPHINOTRICIN-ACETYLTRANSFERASE TEST 27
2.8.2.1. NACHWEIS IN VIVO 27
2.8.2.2. NACHWEIS IN VITRO 27
2.8.3. IMMUNBIOCHEMISCHER NACHWEIS DES PSBMV-HUELLPROTEINS 28
2.8.3.1. PROTEINEXTRAKTION 29
2.8.3.2. DISC-PAGE MIT MINIGELEN 30
2.8.3.3. WESTERN BLOT 30
2.8.3.4. TISSUE-PRINT 30
2.8.3.5. IMMUNOSTAIN 31
2.8.4. NACHWEIS SPEZIFISCHER PAT-TRANSKRIPTE 32
2.8.4.1. ISOLATION VON GESAMT-RNA YY 32
2.8.4.2. ELEKTROPHORESE UND BLOT 33
2.8.4.3. MARKIERUNG DER PAT-SONDE 33
2.8.4.4. HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN 33
II
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3 ERGEBNISSE [34-80]
3.1.
IN VI/RO-REGENERATION VON ERBSEN 34
3.1.1. DIREKTE REGENERATION AUS MERISTEMEN 34
3.1.1.1. VORKULTUR 34
3.1.1.2. DUENNSCHNITTE 35
3.1.1.3. PHYTOHORMONE 35
3.1.1.4. ALTER UND POSITION 36
3.1.1.5. ENTWICKLUNG UND BEWURZELUNG 36
3.1.1.6. INDIVIDUELLE VERGANGENHEIT DER EXPLANTATE 37
3.1.2. INDIREKTE REGENERATION 37
3.1.2.1. REGENERATION AUS KOTYLEDONEN 37
3.1.2.2. REGENERATION AUS LANGZEITKALLUSKULTUREN 40
3.1.2.2.1. .VON EMBRYOACHSEN 40
3.1.2.2.2. .VON EPIKOTYLSEGMENTEN 42
3.1.3. REGENERATION AUS ANDEREN GEWEBEN 42
3.2. ZELLKOMPETENZ FUER DIE
AGROBACTERIUM-VERMITTELTE TRANSFORMATION 43
3.2.1. HISTOCHEMISCHER SCHNELLTEST 43
3.2.2. BESTIMMUNG ALLGEMEINER TRANSFORMATIONSPARAMETER 44
3.2.2.1. KOKULTURDAUER 44
3.2.2.2. SORTENSPEZIFITAET 45
3.2.2.3. STAMMSPEZIFITAET 45
3.2.2.4. SELEKTIERBARER MARKER 46
3.2.2.5. INOKULUM UND WACHSTUMSPHASE 47
3.2.3. CHARAKTERISIERUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER ZELLEN 48
3.2.3.1. POLARITAET 4G
3.2.3.2. ALTER UND DIFFERENZIERUNGSGRAD 49
3.2.3.3. GEWEBESPEZIFITAET * 50
3.2.3.4. EINFLUSS DER PHYTOHORMONE 51
3.2.3.5. DIE BESONDERE ROLLE DER AUXINE 53
3.2.3.6. DIE ABHAENGIGKEIT VON ZELLTEILUNGSFUNKTIONEN 54
3.2.3.7. KORRELATION MIT EINEM PROLIFERATIONS- 57
SPEZIFISCHEN MARKERPROTEIN
3.3. BINDUNG DER AGROBAKTERIEN
5G
3.3.1. BINDUNG VON EHA101C3 5G
3.3.2. DER EINFLUSS VON TUNICAMYCIN, LEKTINEN UND EGTA 62
3.4. ANDERE TRANSFORMMATIONSVERFAHREN 64
3.4.1. PARTIKELKANONE 64
3.4.2. PEG-VERMITTELTE TRANSFORMATION VON PROTOPLASTEN 66
3.5. ZUR PRODUKTION TRANSGENER ERBSEN 68
3.5.1. AUS LANGZEIT-KALLUSKULTUREN 68
3.5.1.1. EFFIZIENZ VON TRANSFORMATION UND REGENERATION 68
3.5.1.2. EXPRESSIONSSTABILITAET DES GUSA-GENS 69
3.5.2. AUS MERISTEMEN 72
3.5.2.1. NODUS-EXPLANTATE 72
3.5.2.2. GEWEBE-DUENNSCHNITTE 74
3.6. TRANSFER VON VIRUS- UND HERBIZIDRESISTENZ 77
3.6.1. EXPRESSION DES HUELLPROTEINGENS 77
3.6.2. PHOSPHINOTRICIN-RESISTENZ 79
III
4 DISKUSSION [81-97]
4.1. ZUR INKOMPATIBILITAET VON REGENERATION UND TRANSFORMATION BEI PISUM
4.2. DAS PROBLEM DER ZELLKOMPETENZ FUER DEN AGROBACTERIUM-
VERMITTELTEN GEN-TRANSFER IN KOERNERLEGUMINOSEN
4.3. ZUR PRODUKTION TRANSGENER ERBSEN UND ANDERER KOERNERLEGUMINOSEN
4.4. ZUR UEBERTRAGUNG VON HERBIZID- UND VIRUSRESISTENZ
5 ZUSAMMENFASSUNG
6 LITERATURVERZEICHNIS
DANKSAGUNG
ERKLAERUNG
LEBENSLAUF |
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