Kinetische Untersuchungen zur Funktion der Lumazinsynthase und der schweren Riboflavinsynthase:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
BIOSYNTHESE
VON
RIBOFLAVIN
.
1
1.2.
STRUKTUR
DER
LUMAZINSYNTHASE
.
8
1.3.
BIOMIMETISCHE
STUDIEN
.
10
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
11
2.1.
CHEMIKALIEN
.
11
DEUTERIERTE
LOESUNGSMITTEL
.
11
LOESUNGSMITTEL
.
11
SONSTIGE
CHEMIKALIEN
.
11
2.2.
TRENNMATERIALIEN
.
12
2.3.
PUFFER
.
12
PUFFER
IN
H2O
.
12
PUFFER
IN
D2O
.
13
2.4.
PROTEINE
.
13
2.5.
PROTEINBESTIMMUNG
.
14
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
14
6,7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZINSYNTHASE
.
14
TEST
AUF
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHATSYNTHASE
.
15
2.6.
PROTEINE
IN
DEUTERIERTEN
PUFFERN
.
16
DIALYSE
.
16
LYOPHILISATION
.
16
2.7.
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
.
17
2.8.
HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
.
17
STATIONAERE
PHASEN
.
17
MOBILE
PHASEN
.
18
BESTIMMUNG
VON
RIBOFLAVIN
.
18
BESTIMMUNG
VON
6,7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZIN
.
18
PRAEPARATIVE
TRENNUNG
VON
MARKIERTEM
RIBOFLAVIN
.
19
2.9.
SPONTANE
LUMAZINBILDUNG
UND
DEUTERIUMAUSTAUSCH AM
SUBSTRAT
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
.
19
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
SPONTANREAKTION
.
19
DEUTERIUMAUSTAUSCH
DER
PROTONEN
AN
C-L
UND
C-3
VON
3,4-DI
HYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
.
19
DEUTERIUMAUSTAUSCH
VON
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOS
PHAT
.
19
DEUTERIUMAUSTAUSCH
VON
R-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOS
PHAT
.
20
2.10.
KINETIK
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
20
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
6,7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZINSYN
THASEAKTIVITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
20
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
21
ABHAENGIGKEIT
DER
6,7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZINSYNTHASEAKTIVI
TAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
VON
DER
ART
DES
PUFFERS
.
21
KINETIK
MIT
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
ALS
SUBSTRAT
.21
KINETIK
MIT
5-AMINO-6-RIBITYLAMINO-2,4(LH,3H)-PYRINIIDINDION
ALS
SUBSTRAT
.
.
.
22
INHIBIERUNG
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
DURCH
DAS
PYRIMI
DO-[5,4-G]-PTERIDIN
.
22
BESTIMMUNG
DES
UMSATZES
VON
S
UND
R-3,4-DIHYDROXY-2-BU
TANON-4-PHOSPHAT
DURCH
DIE
SCHWERE
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
23
TEST
AUF
RACEMASEAKTIVITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
23
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
24
REGIOSPEZIFITAET
DER
KONDENSATION
VON
5-AMINO-6-RIBITYLAMINO-
2,4(LH,3H)-PYRIMIDINDION
MIT
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4
PHOSPHAT
DURCH
DIE
SCHWERE
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
24
2.11.
KINETIK
DER
LUMAZINSYNTHASE
.
25
SSGO-EINHEITEN
.
25
SS
IGO-EINHEITEN
.
25
2.12.
SUBSTRATE CHANNELING
.
26
VERGLEICH
DER
6,7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZIN
UND
RIBOFLAVINBIL
DUNG
DURCH
SCHWERE RIBOFLAVINSYNTHASE
MIT
EINER
MISCHUNG
AUS
FREIEN
013
UND
SSGO-EINHEITEN.
26
ABHAENGIGKEIT
DER
PARTITIONIERUNG
VON
DER
ENZYMKONZENTRATION
.
26
SIMULATIONEN
.
27
2.13.
SYNTHESEN
.
27
(2S)-1,2-O-ISOPROPYLIDEN-L,2,3-BUTANTRIOL
.
27
(2R)-L,2-O-ISOPROPYLIDEN-L,2,3-BUTANTRIOL
.
28
(R)
UND
(S)-3,4-O-ISOPROPYLIDEN-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
.
28
(R)
UND
(S)-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
.
28
(R,S)-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
.
29
BESTIMMUNG
DER
OPTISCHEN
REINHEIT
VON
(R)
UND
(S)-3,4-DI
HYDROXY-2-BUTANON
.
30
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
.
30
5-AMINO-6-RIBITYLAMINO-2,4(LH,3H)-PYRIMIDINDION
.
31
5-AMINO-6-RIBITYLAMINO-2,4(LH,3H)-PYRIMIDINDIONHYDROCHLORID.32
PKS-BESTIMMUNG
VON
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-3-PHOSPHAT
UND
-4-PHOSPHAT
.
32
DARSTELLUNG
UND
REINIGUNG
DES
PYRIMIDO-[5,4-G]-PTERIDINS
.
32
3.
ERGEBNISSE
.
34
3.1.
SUBSTRATE
DER
LUMAZINSYNTHASE
.
34
3.1.1.
SYNTHESE
VON
S-,
R
UND
S,R-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4
PHOSPHAT
.
34
3.1.2.
PHOSPHORYLIERUNG
.
35
3.1.3.
DARSTELLUNG
VON
R-7
UND
S-7
.
39
3.1.4.
EIGENSCHAFTEN
VON
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
.
42
3.1.4.1.
PKS-WERT
.
42
3.1.4.2.
STABILITAET
.
43
DIACETYLBILDUNG
BEI RAUMTEMPERATUR
UND
37
C
.
43
3.1.4.3.
DEUTERIUMAUSTAUSCH
AM
CI
VON
7
.
46
EINFLUSS
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
AUF
DEN
DEUTERIUM
AUSTAUSCH AN
C-L
.
46
EINFLUSS
DER
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHATSYNTHASE
AUF
DEN
DEUTERIUMAUSTAUSCH
C-L
VON
7
.
48
DEUTERIUMAUSTAUSCH
AN
C-L
VON
7
UNTER
DEM
EINFLUSS
DES
SUBSTRATES
6
.
49
3.1.4.4.
DEUTERIUMAUSTAUSCH
DES
PROTONS
AN
C-3
VON
7
.
50
3.2.
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LUMAZINSYNTHASEAKTIVITAET
DER
ENZYMSPEZIES
A
3
SS
60
,
SSEO
UND
SS
LG0
.
53
3.2.1.
VORVERSUCHE
.
53
3.2.1.1.
SPONTANREAKTION
.
53
3.2.1.2.
TEMPERATUREINFLUSS
.
54
3.2.1.3.
ABHAENGIGKEIT
DER
LUMAZINSYNTHASEAKTIVITAET
VOM
PH-WERT
.
56
3.2.1.4.
ABHAENGIGKEIT
DER
LUMAZINSYNTHASEAKTIVITAET
VON
DER
ART
DES
PUFFERS
.
57
3.2.1.5.
AKTIVITAET
DER
SSI
80
-
UND
SS
6
O-EINHEITEN
.
58
SS
ISO-AKTIVITAET
.
58
NATIVE
ELEKTROPHORESE
.
59
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
60
SS
60
-
AKTIVITAET
.
62
AKTIVITAET
VON
LIGANDIERTEN
SS
60
-EINHEITEN
.
63
3.2.2.
KINETISCHE
EXPERIMENTE
UNTER
STEADY-STATE-BEDINGUNGEN
.
64
3.2.2.1.
KINETIK
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
MIT
5-AMINO-6
RIBITYLAMINO-(LH,3H)-PYRIMIDINDION
(6)
ALS
SUBSTRAT
.
64
3.2.2.2.
KINETIK
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
MIT
S-3,4-DIHYDROXY
2-BUTANON-4-PHOSPHAT
(7)
ALS
SUBSTRAT
.
65
3.2.2.3.
KINETIK
DER
SSI
G0
-EINHEITEN
MIT
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4
PHOSPHAT
(7)
ALS
SUBSTRAT
.
66
3.2.2.4.
KINETIK
DER
SS^-EINHEITEN
MIT
S-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4
PHOSPHAT
(7)
ALS
SUBSTRAT
.
67
3.2.2.S.
ABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAETEN
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
VON
DER
REINHEIT
DER
SUBSTRATE
.
69
HEMMUNG
DER
A-AKTIVITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSNYHTASE
DURCH
26
.
70
HEMMUNG
DER
SS-UNTEREINHEITEN
DURCH
26
.
71
3.3.
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
73
3.3.1.
IST
DIACETYL
EIN
SUBSTRAT
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE?
.
73
3.3.2.
IST
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-3-PHOSPHAT
EIN
SUBSTRAT
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE?
.
74
3.4.
STEREOSPEZIFITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
75
3.4.1.
UMSATZBESTIMMUNG
.
75
3.4.2.
UNTERSUCHUNG
AUF
RACEMASEAKTIVITAET
DER
SCHWEREN
'
RIBOFLAVINSYNTHASE
.
76
3.5.
REGIOSPEZIFITAET
.
78
3.6.
SUBSTRATE
CHANNELING
.
80
3.6.1.
DIREKTE
HINWEISE FUER
SUBSTRATE
CHANNELING
.
81
VERGLEICH
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVINSYNTHASE
MIT
EINER
MISCHUNG
AUS
A
UND
SS-UNTEREINHEITEN
.
84
3.6.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PARTITIONIERUNG
IN
DER
SCHWEREN
RIBO
FLAVINSYNTHASE
.
86
3.6.2.I.
BERECHNUNG
DER
PARTITIONIERUNG
.
86
3.6.2.2.
PH-ABHAENGIGKEIT
DES
PARTITIONIERUNGSKOEFFIZIENTEN
.
87
3.6.2.3.
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DES
PARTITIONIERUNGSKOEFFIZIENTEN
.
88
3.6.2.4.
EINFLUSS
DES
PUFFERS
.
89
3.6.2.5.
EINFLUSS
VON
R-3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
AUF
DIE
PARTITIONIERUNG
.
90
3.6.2.6.
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
SUBSTRATKONZENTRATION
.
91
3.6.2.7.
ABHAENGIGKEIT
DES
PARTITIONIERUNGSKOEFFIZIENTEN
VON
DER
ENZYM
KONZENTRATION
.
92
3.6.2.8.
EINFLUSS
VON
S-7
AUF
DIE
RIBOFLAVINBILDUNG
.
93
3.6.3.
SIMULATIONEN
.
95
4.
DISKUSSION
.
106
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
5.
6.
7.
SYNTHESE
VON
S-,
R
UND
RACEMISCHEM
3,4-DIHYDROXY-2
BUTANON-4-PHOSPHAT
.
106
STABILITAET
.
107
SPONTANREAKTION
.
109
KINETIK
DER
LUMAZINSYNTHASE
.
109
SUBSTRATE
CHANNELING
.
113
SIMULATION
.
117
ZUSAMMENFASSUNG
.
119
LITERATURVERZEICHNIS
.
122
ANHANG
.
138
BERECHNUNG
DER
RIBOFLAVINKONZENTRATION
DURCH
INTEGRATION
DER
MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG
BEI
LINEAR
STEIGENDER
SUBSTRATKON
ZENTRATION
.
138
BERECHNUNG
DER
REGIOSPEZIFITAET
DER
KONDENSATION
VON
S-[L
13
CI]-7
MIT
6
ZU
9
.
138
BERECHNUNG
DER
STEREOSELEKTIVITAET
DER
SCHWEREN
RIBOFLAVIN
SYNTHASE FUER
S-7
.
139 |
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