Klonierung neuer Mitglieder der Familie der Na + -/CI - -abhängigen Neurotransmittertransporter: die Kreatintransporter aus Kaninchen und aus Torpedo
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
MEDIZINISCHE
UND
BIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER
NA
+
-ABHAENGIGEN
TRANSPORTER
FUER
NEUROTRANSMITTER
2
1.2
METHODEN
ZUR
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRANSPORTERN
FUER
NEUROTRANSMITTER
5
1.3
UEBERBLICK
UEBER DIE
NA
+
-ABHAENGIGEN
TRANSPORTER
FUER
NEUROTRANSMITTER
7
1.3.1
DIE
FAMILIE
DER
GABA-/NORADRENALINTRANSPORTER
8
1.3.2
DIE
FAMILIE
DER
GLUTAMATTRANSPORTER
9
1.4
ZIEL
DER
ARBEIT
UND
VORGEHENSWEISE
10
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
13
2.1
MATERIAL
13
2.2
ISOLIERUNG,
ANREICHERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
RNA
16
2.2.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
16
2.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
NACH
AUFFRAY
UND
ROUGEON
16
2.2.1.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
NACH
P.
CHOMCZYNSKI
16
2.2.1.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
NACH
PHARMACIA
17
2.2.2
ANREICHERUNG
VON
POLY
(A)
+
RNA
MIT
OLIGO
(DT)
CELLULOSE
18
2.2.3
GROESSENFRAKTIONIERUNG
VON
POLY
(A)
+
RNA
18
2.2.4
GELEKTROPHORESE
VON
POLY
(A)
+
RNA
UND
TRANSFER
AUF
EINE
NYLONMENBRAN
19
2.3
AMPLIFIKATION
VON
CDNA
DURCH
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
20
2.3.1
ELUTION
DER
OLIGONUKLEOTIDE
VON
DEN
SYNTHESESAEULEN
20
2.3.2
SYNTHESE
DES
CDNA-ERSTSTRANGS
20
2.3.3
"BOOSTER'
'
PCR
21
2.4
METHODEN
ZUR
KLONIERUNG
VON
CDNA
22
2.4.1
GELELEKTROPHORESE
UND
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
22
2.4.2
VORBEREITUNG
DES
VEKTORS
ZUR
LIGATION
23
2.4.2.1
RESTRIKTION
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
DES
VEKTORS
23
2.4.2.2
HERSTELLUNG
DES
"T"
VEKTORS"
23
2.4.3
LIGATION
24
2.4.4
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
24
2.4.4.1
KOMPETENTE
ZELLEN
MIT
DER
CA&2
METHODE
24
2.4.4.2
KOMPETENTE
ZEILEN
NACH
HANAHAN
25
2.4.4.3
TRANSFORMATION
25
2.5
PLATTIERUNG
VON
PHAGEN
UND
TRANSFER
DER
PHAGEN-DNA
AUF
NITROCELLULOSE
26
2.5.1
PLATTIERUNG
VON
XGT10
PHAGEN
26
2.5.2
PLATTIERUNG
VON
XZAPII
PHAGEN
27
2.5.3
TRANSFER
DER
PHAGEN-DNA
AUF
NITROCELLULOSE
27
2.6 RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
28
2.6.1
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
"NICK
TRANSLATION"
28
2.6.2
5'-ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
29
2.7
HYBRIDISIERUNG
IMMOBILISIERTER
NUKLEINSAEUREN
29
2.7.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
32
P-MARKIERTER
CDNA
29
2.7.1.1
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHEM-BLOT
MIT
32
P-MARKIERTER
CDNA
29
2.7.1.2
HYBRIDISIERUNG
VON
REPLIKA-FILTEM
MIT
32
P-MARKIERTER
CDNA
30
2.7.2
HYBRIDISIERUNG
VON
REPLIKA-FILTEM
UND
SOUTHEM-BLOT
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
30
2.8
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
VON
DNA
31
2.8.1
ISOLIERUNG
VON
LAMBDA
DNA
(KLEINER
MASSSTAB)
32
2.8.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IN
KLEINEM
MASSSTAB
32
2.8.3.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IN
GROSSEM
MASSSTAB
33
2.8.4
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
M13-DNA
34
2.9
IN
VIVO
EXCISION
VON
PBLUESCRIPT
AUS
XZAP
II
PHAGEN
34
2.10
DNA-SEQUENZIERUNG
UND
GELELEKTROPHORESE
35
2.10.1
KREUZHYBRIDISIERUNG
EINZELSTRAENGIGER
M13-DNA
35
2.10.2
SEQUENZIERUNG
35
2.10.3 GELELEKTROPHORESE
DER
SEQUENZIERTEN
DNA
36
2.10.4 AUSWERTUNG
VON
DNA-SEQUENZEN
36
2.11
METHODEN
ZUR
EXPRESSION
VON
CDNA-KLONEN
37
2.11.1
EXPRESSION
VON
RNA
IN
DEN
OOZYTEN
VON
XENOPUS
LAEVIS
37
2.11.1.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
DER
CDNA
37
2.11.1.2
HALTUNG
VON
XENOPUS
LAEVIS
38
2.11.1.3
ISOLIERUNG
DER
XENOPUS-OOZYTEN
38
2.11.1.4
MIKROINJEKTION
VON
RNA
IN
XENOPUS-OOZYTEN
39
2.11.1.5
AUFNAHMETEST
IN
XENOPUS-OOZYTEN
40
2.11.2
EXPRESSION
IN
COS
7
ZELLEN
40
2.11.2.1
KLONIERUNG
IN
PSVL
40
2.11.2.2
COS-7-ZELLEN
UND
IHRE
KULTIVIERUNG
42
2.11.2.3
TRANSFEKTION
DER
COS
7-ZELLEN
MIT
DEAE-DEXTRAN/DMSO
43
2.11.2.4
AUFNAHMETEST
IN
COS
7-ZELLEN
43
2.11.3 AUSWERTUNG
DER
AUFNAHMETESTS
44
3.
ERGEBNISSE
45
3.1
VERSUCHE
ZUR
EXPRESSIONSKLONIERUNG
45
3.1.1
BESTIMMUNG
DER
VON
POLY(A)+
RNA-FRAKTIONEN
AUS
KANINCHENHIM
INDUZIERTEN
L-GLUTAMAT-TRANSPORTAKTIVITAET
45
3.1.2
WEITERE
VERSUCHE
48
3.2
KLONIERUNG
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
KANINCHEN
KREATINTRANSPORTERS
MIT
HILFE
DER
PCR
49
3.2.1
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
GABA
UND
NORADRENALINTRANSPORTER,
AUSWAHL
DER
PRIMER
FUER
DIE
PCR
49
3.2.2
PCR
ERGEBNISSE
50
3.2.2.1
AMPLIFIZIERTE
DNA-FRAGMENTE
AUS
TORPEDO
(LOBUS
ELECTRICUS)
50
3.2.2.2
AMPLIFIZIERTE
DNA-FRAGMENTE
AUS
KANINCHENHIM
51
3.2.3
SCREENING
EINER
AE.GT10
CDNA-BANK
AUS
KANINCHENHIM
52
3.2.4
KLONIERUNG
VON
KHB4
UND
KHB6
IN
PBLUESCRIPT
54
3.2.5
CDNA-SEQUENZ
VON
KHB4
UND
KHB6
54
3.2.6
VERSUCHE
ZUR
EXPRESSION
DER
KLONE
KHB4
UND
KHB6
IN
XENOPUS-OOZYTEN
57
3.2.7
HYBRIDISIERUNG
VON
MRNA
AUS
VERSCHIEDENEN
KANINCHENGEWEBEN
MIT
KHB6
58
3.2.8
SCREENING
EINER
XGT1O
CDNA-BANK
AUS
WEISSEM
KANINCHENMUSKEL
60
3.2.9
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
TRANSPORTER
DER
FAMILIE
DER
GABA-/NORADRENALIN-TRANSPORTER
60
3.2.10
IDENTIFIZIERUNG
DES
KHB4-KLONS
ALS
KREATINTRANSPORTER
NACH
EXPRESSION
IN
COS
7-ZELLEN
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
TRANSPORTERS
62
3.2.10.1
KLONIERUNG
DER
KHB4
UND
KHB6
KLONE
IN
PSVL
62
3.2.10.2
KHB4
UND
KHB6
KODIEREN
FUER
EINEN
KREATINTRANSPORTER
63
3.2.10.3
ANIONEN-UND
KATIONENABHAENGIGKEIT
DES
KREATINTRANSPORTERS
65
3.2.10.4
SUBSTRATAFFINITAET
DES
KREATINTRANSPORTERS
67
3.2.10.5''
SUBSTRATSPEZIFITAET
DES
KREATINTRANSPORTERS
70
3.2.11
KHB4-INDUZIERTE
KREATINAUFNAHME
IN
DEN
XENOPUS-OOZYTEN
72
3.3.
KLONIERUNG
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
DURCH
PLAQUE
SCREENING
MIT
EINEM
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEOTID
73
3.3.1
SCREENING
EINER
XZAP
II
CDNA-BANK
AUS
TORPEDO
MARMORATA
(LOBUS
ELECTRICUS)
73
3.3.2
GRUPPIERUNG
DER
KLONE
-
PARTIELLE
SEQUENZIERUNG
74
3.3.2.1
GRUPPE
1
75
3.3.2.2.
GRUPPE
2
76
3.3.2.3.
GRUPPE
3
77
3.3.2.4
GRUPPE
4
78
3.3.3
CDNA-SEQUENZ
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
(T1
3)
81
3.3.3.1
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
81
3.3.3.2
CDNA-SEQUENZ
82
3.3.4
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
84
3.3.4.1
T1
3
KODIERT
FUER
EINEN
KREATINTRANSPORTER
84
3.3.4.2
SUBSTRATAFFINITAET
DES
KREATINSTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
85
3.3.4.3.
SUBSTRATSPEZIFITAET
DES
KREATINSTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
86
3.4
UNTERSUCHUNG
DER
KREATINTRANSPORTERSEQUENZEN
90
4
DISKUSSION
4.1
KLONIERUNGSTRATEGIE
93
4.2
KLONIERUNG
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
KANINCHEN
94
4.2.1
STRUKTUR
DES
PROTEINS
95
4.2.2
GEWEBESPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
KLONIERTEN
TRANSPORTERS
96
4.2.3
AUSWAHL
DES
KREATINS
ALS
SUBSTRAT
97
4.2.4
DER
KLONIERTE
TRANSPORTER
TRANSPORTIERT
KREATIN
98
4.2.5
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DES
KREATINTRANSPORTERS
99
4.2.6
EIGENE
ERGEBNISSE
VERSUS
MAYSER
ET
AL.
(1992)
100
4.3
KLONIERUNG
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
DURCH
PLAQUE-SCREENING
-
UNTERSUCHUNG
DER
SEQUENZEN
DER
KREATINTRANSPORTER
AUS
TORPEDO
UND
KANINCHEN
102
4.3.1
STRUKTUR
UND
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DES
KREATINTRANSPORTERS
AUS
TORPEDO
-
VERGLEICH
MIT
KREATINTRANSPORTEM
AUS
SAEUGETIEREN
103
4.3.2
UNTERSUCHUNG
DER
SEQUENZEN
DER
KREATINTRANSPORTER
AUS
TORPEDO
UND
AUS
KANINCHEN
105
4.4
BEDEUTUNG
DER
KREATINTRANSPORTER
-
PERSPEKTIVE
107
5
ZUSAMMENFASSUNG
110
6
ANHANG
112
7
LITERATUR
115 |
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| spelling | Guimbal, Cécile Verfasser aut Klonierung neuer Mitglieder der Familie der Na + -/CI - -abhängigen Neurotransmittertransporter die Kreatintransporter aus Kaninchen und aus Torpedo vorgelegt von Cécile Guimbal 1994 126 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bochum, Univ., Diss., 1994 Carrier-Proteine (DE-588)4213127-3 gnd rswk-swf Neurotransmitter (DE-588)4041905-8 gnd rswk-swf Synaptische Vesikel (DE-588)4184227-3 gnd rswk-swf Genklonierung (DE-588)4123275-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Synaptische Vesikel (DE-588)4184227-3 s Neurotransmitter (DE-588)4041905-8 s Carrier-Proteine (DE-588)4213127-3 s Genklonierung (DE-588)4123275-6 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006548893&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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