Zur biologischen Funktion proteingebundener Fettsäuren am Beispiel viraler Glykoproteine:
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| Sprache: | German |
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1994
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INHALT
SEITE
ABKUERZUNGEN
7
1.
EINFUEHRUNG
8
2.
ZIELSETZUNG
27
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
28
3.1
MATERIAL
28
3.1.1
VIREN
28
3.1.2
ZELLKULTUREN
28
3.1.3
BESONDERE
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
29
3.1.4
FEINCHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
"KITS"
29
3.1.5
PUFFER
30
3.2
METHODEN
31
3.2.1
ARBEITEN
MIT
VIRUSPARTIKELN
31
3.2.1.1
HERSTELLUNG
KONZENTRIERTER
VIRUSSUSPENSIONEN
31
3.2.1.1.1
INFLUENZA
A-VIREN
31
3.2.1.1.2
ALPHAVIREN
UND
RHABDOVIREN
31
3.2.1.2
REINIGUNG
DER
VIRUSSUSPENSIONEN
32
3.2.1.3
HAEMAGGLUTINATIONSTESTS
32
3.2.1.3.1
GEWINNUNG
UND
AUFBEREITUNG
DER
ERYTHROZYTEN
32
3.2.1.3.2
HAEMAGGLUTINATIONSTEST
MIT
INFLUENZAVIREN
33
3.2.1.3.3
HAEMAGGLUTINATIONSTEST
MIT
TOGA
UND
RHABDOVIREN
33
3.2.1.4
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
33
3.2.1.5
ENTFERNUNG
DER
SALZLOESUNGEN
DURCH
MEMBRANFILTRATION
34
3.2.1.6
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
34
3.2.1.7
HAEMOLYSETESTS
34
3.2.1.8
NEURAMINIDASETEST
35
3.2.2
PROTEINEXPRESSION
IN
INSEKTENZELLEN
35
3.2.2.1
HERSTELLUNG
UND
TITRATION
REKOMBINANTER
ACMNPV-KLONE
35
3.2.2.1.1
UMKLONIEREN
DES
GENOMS
VON
WILDTYP
BZW.
MUTIERTEM
HA
(SUBTYP
HY)
IN
EIN
FUER
DIE
TRANSFORMATION
GEEIGNETES
PLASMID
35
3.2.2.1.1.1
VERDAU
VON
PLASMIDEN
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
38
3.2.2.1.1.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNS-FRAGMENTEN
38
3.2.2.1.1.3
RUECKGEWINNUNG
VON
DNS
AUS
DEM
AGAROSEGEL
38
3.2.2.1.1.4
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIENZELLEN
MIT
DEM
LIGATIONSPRODUKT
39
3.2.2.1.1.5 SELEKTION
UND
VERMEHRUNG
VON
BAKTERIENKLONEN
39
3.2.2.1.1.6
TRANSFORMATION
VON
INSEKTENZELLEN
MIT
LINEARISIERTER
ACMNPV-DNS
40
3.2.2.1.1.7
PLAQUETEST
VON
BAKULOVIREN
IN
DER
INSEKTENZELLKULTUR
40
3.2.2.1.1.8 VERMEHRUNG
REKOMBINANTER
ACMNP-VIREN
41
3.2.2.2
NACHWEISMETHODEN
FUER
EXPRIMIERTES
HA
41
3.2.2.2.1
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
FUER
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
41
3.2.22.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
UND
FLUOROGRAPHIE
43
3.2.2.23
WESTERN
BLOT
43
3.2.2.2.4
HAEMADSORPTION
44
3.2.2.2.5
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
33
S-METHIONIN
UND
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
44
3.2.2.3
CHEMISCHE
QUERVEMETZUNG
EXPRIMIERTER
HA-MOLEKUELE
44
3.2.2.4
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
3
H-PALMITINSAEURE
45
3.2.2.5
HAEMOLYSETESTS
MIT
INSEKTENZELLYSATEN
45
4.
ERGEBNISSE
46
4.1
EINFLUSS
DER
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
AUF
EIGENSCHAFTEN
VIRALER
SPIKEGLYKOPROTEINE
46
4.1.1
HAEMAGGLUTINATIONSAKTIVITAET
46
4.1.1.1
VORVERSUCHE
FUER
HAEMAGGLUTINATIONSTESTS
MIT
TOGA
UND
RHABDOVIREN
46
4.1.1.1.1
BLUT
VERSCHIEDENER
SPEZIES
46
4.1.1.1.2
BESTIMMUNG
VON
PH-OPTIMA
FUER
DIE
HAEMAGGLUTINATIONSREAKTION
47
4.1.1.2
DIE
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
HEMMT
DIE
HAEMAGGLUTINATIONSFAEHIGKEIT
BESTIMMTER
VIREN
48
4.1.2
PARTIKELINTEGRITAET
UND
MORPHOLOGIE
50
4.1.2.1
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
50
4.1.2.2 UNTERSUCHUNG
DES
SEDIMENTATIONSVERHALTENS
VON
HYDROXYLAMINBEHANDELTEN
SFV-PARTIKELN
IM
SACCHAROSE
GRADIENTEN
54
4.1.3
HAEMOLYSEAKTIVITAET
58
4.1.3.1
VORVERSUCHE
ZUR
METHODIK
58
4.1.3.1.1
EMPFINDLICHKEIT
DER
QUANTITATIVEN
HAEMOLYSEMESSUNG
58
4.1.3.1.2
ENTFERNUNG
DER
SALZE
AUS
DEM
VERSUCHSANSATZ
59
4.1.3.2
EINFLUSS
DER
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
AUF
DIE
HAEMOLYSE
AKTIVITAETEN
ZWEIER
VSV-STAEMME
60
4.1.3.3 EINFLUSS
DER
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
AUF
DIE
HAEMOLYSEAKTIVITAETEN
VON
VIER
VERSCHIEDENEN
INFLUENZA-A-VIRUSSTAEMMEN
61
4.1.3.4
DIE
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
BEEINFLUSST
DIE
MEMBRANBINDUNG
BESTIMMTER
INFLUENZASTAEMME
BEI
NIEDRIGEM
PH-WERT
62
4.1.4
EINFLUSS
DER
HYDROXYLAMINBEHANDLUNG
AUF
DIE
NEURAMINIDASE
AKTIVITAET
65
4.2
EXPRESSION
VON
WILDTYP
KP-HA
(H7)
UND
EINER
FETTSAEUREFREIEN
HY-MUTANTE
MIT
DEM
BAKULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
67
4.2.1
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STRUKTUR
67
4.2.1.1
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
35
S-METHIONIN
67
4.2.1.2
DIE
EXPRIMIERTE
HY-MUTANTE
ENTHAELT
KEINE
PROTEINGEBUNDENEN
FETTSAEUREN
70
4.2.1.3
DIE
ACYLIERUNG
VON
EXPRIMIERTEM
WILDTYP-HA
IST
HYDROXYLAMINLABIL
70
4.2.1.4
NACHWEIS
EXPNMIERTER
HA-MOLEKUELE
MIT
DEM
WESTERN
BLOT
71
4.2.1.5 VERGLEICH
DER
QUARTAERSTRUKTUREN
MITTELS
CHEMISCHER
QUERVERNETZUNG
74
4.2.2
EXPRIMIERTES
FETTSAEUREFREIES
HA
HAT
KEINE
ANDEREN
FUNKTIONELLEN
EIGENSCHAFTEN
ALS
NORMAL
ACYLIERTES
77
4.2.2.1
DAS
IN
INSEKTENZELLEN
EXPRIMIERTE
FETTSAEUREFREIE
HA
WIRD
AN
DIE
ZELLOBERFLAECHEN
TRANSPORTIERT
77
4.2.2.2
LYSATE
VON
INSEKTENZELLEN,
DIE
FETTSAEUREFREIES
HA
ENTHALTEN,
VERURSACHEN
HAEMOLYSE
79
4.2.2.3
DIE
HEMMUNG
DER
HAEMOLYSEAKTIVITAET
VON
KP
DURCH
HYDROXYLAMIN
IST
NICHT
AN
DESSEN
DEACYLIERENDE
AKTIVITAET
GEKOPPELT
80
4.2.2.4
MESSUNG
DER
HA-INDUZIERTEN
MEMBRANFUSION
AN
DER
OBERFLAECHE
VON
INSEKTENZELLEN
EXPRIMIERTES
HA
LOEST
MEMBRANVERSCHMELZUNGSVORGAENGE
AUS
81
4.2.2.4.1
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
81
4.2.2.4.2
QUANTIFIZIERUNG
DER
MEMBRANFUSIONSVORGAENGE
MIT
DEM
R-JG-TEST
85
4.2.2.4.3
DIE
PH-WERT-ABHAENGIGKEIT
ZUR
AUSLOESUNG
DER
MEMBRANFUSIONS
AKTIVITAET
IST
FUER
WILDTYP
UND
FETTSAEUREFREIES
HA
IDENTISCH
87
5.
DISKUSSION
89
6.
ZUSAMMENFASSUNG
104
7.
SUMMARY
106
8.
SCHRIFTTUM
108 |
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