Mini-Antikörper: bivalente, tetravalente und bispezifische Immunglobuline aus E. coli
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.1.
PROTEIN
ENGINEERING:
ANSPRUCH
UND
WIRKLICHKEIT
1
1.1.2.
IMMUNGLOBULINE
ALS
ZIEL
EINER
"VERBESSERUNG"
3
1.13.
AUSTAUSCHBARE
MODULE
STATT
AB
INITIO
PLANUNG
6
1.1.4.
EINE
ALTERNATIVE
STRATEGIE
ZUR
EXPRESSION
"UNNATUERLICHER"
MULTIFUNKTIONS
6
IMMUNGLOBULINE
13.
FRAGESTELLUNG
UND
ZIEL
DER
VORLIEGENDEN
DOKTORARBEIT
8
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1.1.
ORGANISMEN
9
2.1.2.
PLASMIDE
UND
OLIGONUKLEOTIDE
9
2.1.3.
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
KITS
10
2.1.4.
GERAETE
UND
MATERIALIEN
11
2.1.5.
ALPHABETISCHE
AUFLISTUNG
ALLER
PUFFER
UND
MEDIEN
13
2.1.6.
ANTIBIOTIKA-STAMMLOESUNGEN
18
23.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
18
2.2.1.
HANDHABUNG
VON
E.
COLI
KULTUREN
18
2.2.2.
ANALYTISCHE
PLASMID-SCHNELLPRAEPARATION
AUS
2
ML-KULTUREN
19
2.2.3.
PRAEPARATIVE
PLASMID-PRAEPARATION
(MIDI)
19
2.2.4.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
PLASMID-DNA
20
2.2.5.
ANALYTISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
20
2.2.6.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
UND
PHENOLISIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
2.2.7.
AUFFUELLUNG
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
21
2.2.8.
GENSYNTHESE
22
2.2.9.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
23
2.2.10.
GEZIELTE
MUTAGENESE
EINZELSTRAENGIGER
DNA
23
2.2.11.
TRANSFORMATION
NACH
HANAHAN
25
2.2.12.
SICHTUNG
POSITIVER
KLONE
DURCH
PCR
26
2.2.13.
SEQUENZIERUNGEN
VON
PLASMID-DNA
27
23.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
28
2.3.1.
DIE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
IMMUNGLOBULINE
28
2.3.2.
PENPLASMAAUFSCHLUSS
ZUR
DETEKTION
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
28
2.33.
PRAEPARATIVE
REINIGUNG
AUS
41-SCHTITTELKULTUREN
28
2.3.4.
AFFINITATSREINIGIUNG
PHOSPHORYLCHOLIN-BINDENDER
IMMUNGLOBULINE
29
23.5.
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
30
2.3.6.
WESTERN
BLOT:
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
PROTEINE
31
23.7.
DARSTELLUNG
DES
HAPTENTRAGERS
BSA-PC
33
2.3.8.
FUNKTIONELLER
FRAGMENT-ELISA
(FF-ELISA)
34
23.8.1.
STANDARD-VORSCHRIFT
ZUR
DURCHFUEHRUNG
EINES
FF-ELISA
35
23.8.2.
ZUSAETZLICHE
MASSNAHMEN
ZUR
VERMEIDUNG
VON
ARTEFAKTEN
38
2A.
MESSUNG
DER
REAKTIONSKINETIK
NACH
DER
BIACORE-METHODE
39
23.
COMPUTERUNTERSTUETZUNG
40
3.
ERGEBNISSE
41
3.1
ENTWICKLUNG
EINES
SENSITIVEN
ELISA
ZUR
DETEKTION
UND
QUANTIFIZIERUNG
FUNKTIONELLER
ANTIKOERPER-FRAGMENTE
(FF-ELISA)
41
3.1.1.
GEWUENSCHTE
EIGENSCHAFTEN
UND
PRINZIP
EINES
FF-ELISA
41
3.1.2.
ERSTE
BINDUNGSTESTS
IM
FF-ELISA
42
32.
PLANUNG
UND
SYNTHESE
UNTERSCHIEDLICHER
DOMAENEN
ZUR
OLIGOMERISIERUNG
MONOMERER
ANTIKOERPERFRAGMENTE
IN
VIVO
43
3.2.1.
AUSWAHL
EINER
FLEXIBLEN
SCHARNIER-REGION
44
3.2.2.
AUSWAHL
ASSOZIIERENDER
STRUKTUREN
45
3.2.2.1.
PARALLEL
ASSOZIIERENDE
LEUZIN-ZIPPER
46
3.2.2.2.
ANTIPARALLEL
ASSOZIIERENDE
BUENDEL-HELICES
47
3.23.
KLONIERUNG
DER
ASSOZIIERUNGS-DOMAENEN
50
3.23.1.
BNE
UNGEPLANTE
MUTATION
FUEHRTE
ZUM
SCHLXC
54
33.
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
MINI-ANTIKOERPER
54
3.3.1.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
54
33.2.
GROESSENBESTIMMUNG
IM
SDS-OEL
55
3.33.
GROESSENBESTIMMUNG
DURCH
ULTRAZENTRIFUGATION
56
3.3.4.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
MIM-ANTIKOERPER
IM
FF-ELISA
60
3A.
EXEMPLARISCHE
ANWENDUNGEN
DER
MINI-ANTIKOERPER
IM
FF-ELISA
64
3.4.1.
QUANTIFIZIERUNG
ANHAND
ROHER
ZELL-AUFSCHLUESSE
64
3.4.2.
TEMPERATURSTABIHTAET
68
3.43.
EXPRESSIONSVERHALTEN
IN
SCHUETTELKULTUREN
70
35.
VIER-HELIX
BUENDEL
ALS
ASSOZIIERUNGSMOTIVE
71
3.5.1.
MINI-ANTIKOERPER
SCDHLX:
EIN
ANTIPARALLELES
VIER-HELIX
BUENDEL
DESIGN
72
3.5.1.1.
DIMERISIERUNGSZUSTAND
DES
SCDHLX
72
3.5.1.2.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
IM
FF-ELISA
73
3.5.1.3.
PROTEOLYTISCHE
STABILITAET
UND
HYDROPHOBE
INTERAKTIONEN
77
3.5.2.
MINI-ANTIKOERPER
SCTETRAZIP:
EIN
PARALLELES
VIER-HELIX
BUENDEL
DESIGN
81
3.5.2.1.
KLONIERUNG
EINER
TETRAMENSIERENDEN
ASSOZIIERUNGSDOMAENE
81
3.5.2.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
SCTETRAZIP
82
3.5.23.
GROESSENBESTIMMUNG
DES
SCTETRAZIP
85
3.5.2.4.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DES
SCTETRAZIP
IM
FF-ELISA
87
3.5.2.5.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DES
GROEL/SCTETRAZIPKOMPLEXES
90
3.6.
ERMITTLUNG
DER
KINETISCHEN
BINDUNGSRATEN
VON
MINI-ANTIKOERPERN
92
3.6.1.
MESSPNNZIPDERBIACORE-TECHNOLOGIE
92
3.6.1.1.
AUSWERTUNG
EINES
BLACORE-SENSOGRAMMS
95
3.6.2.
PHOSPHORYLCHOLIN-BINDENDE
IMMUNGLOBULINE
IM
BIACORE-TEST
97
3.6.2.1.
BINDUNGSVERHALTEN
DES
MONOMEREN
SCFV
IM
BIACORE
97
3.OE.2.2.
BINDUNGSVERHALTEN
DER
MINI-ANTIKORPER
IM
BIACORE
98
3.7.
BISPEZIFISCHE
MINI-ANTIKOERPER
104
3.7.1.
SYNTHESE
UND
EXPRESSION
JUN
UND
FOS
BASIERENDER
ASSOZIIERUNGSDOMAENEN
104
3.7.1.1.
STABILISIERUNG
GEGEN
PROTEOLYTISCHE
DEGRADIERUNG
105
3.7.I.2.
HOMO-DIMERISIERUNGSTENDENZEN
1
J2
3.7.13.
BEDINGUNGEN
ZUR
FORMIERUNG
VON
HETERO-DIMEREN
113
4.1.
ANWENDUNGSORIENTIERTE
CHARAKTERISIERUNGEN
VON
MINI-ANTIKOERPERN,
DURCHGEFIIHRT
IM
RAHMEN
VON
KOLLABORATIONEN
120
4.1.1.
HOCHZELLDICHTE-FERMENTATION
DES
SCDHLX
120
4.1.2.
PHARMAKOKINETIK
VON
SCZIP
UND
SCDHLX
122
5.
DISKUSSION
124
5.1.
INTRINSISCHE
UND
FUNKTIONELLE
AFFINITAET
(AVIDITAET)
VON
ANTIKOERPERN
124
5.1.1.
THEORETISCHER
HINTERGRUND
ZUR
FUNKTIONELLEN
AFFINITAET
125
5.2.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
MINI-ANTIKOERPER
128
5.2.1.
BIVALENTE
BINDUNG
IM
FF-ELISA
128
5.2.2.
TETRAVALENTE
MINI-ANTIKOERPER
IM
FF-ELISA
129
5.23.
BINDUNGSKINETIKEN
IM
BIACORE
132
5.2.4.
MOLEKULARE
URSACHEN
FUER
UNTERSCHIEDE
IN
DER
FUNKTIONELLEN
AFFINITAET
DER
MINI-ANTIKOERPER
134
5.2.4.1
.
STABILITAET
DER
DIMERE
134
5.2.4.2.
DENATURIERUNG
ODER
FEHLFALTUNG
EINER
BINDUNGSSTELLE
135
5.2.43.
REICHWEITE,
FLEXIBILITAET
UND
ADAPTIONSFAEHIGKEIT
136
53.
OPTIMIERUNGSSTRATEGIEN
UND
ANWENDUNGEN
FLIR
MINI-ANTIKOERPER
137
5.3.1.
AUSWAHL
EINES
SPEZIELLEN
DESIGNS
FUER
DIAGNOSTIK
UND
THERAPIE
138
53.2.
ALTERNATIVE
ANSAETZE
FUER
BISPEZIFISCHE
ASSOZIIERUNGS-DOMAENEN
139
54.
AUSBLICK
143
6.
ZUSAMMENFASSUNG
145
7.
LITERATUR
147
LEBENSLAUF
166 |
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